氯離子通道蛋白-1(GLIC1)在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景及目的：
　　 結(jié)腸癌是常見的消化道惡性腫瘤，其治療目前仍以手術(shù)為主。雖然腫瘤被完全切除，但術(shù)后仍可能發(fā)生播散性轉(zhuǎn)移，術(shù)后5年生存率較低，約50％，近半數(shù)病例術(shù)后2年出現(xiàn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。氯離子通道蛋白-1(Chloride intracellular channel1，CLIC1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種離子通道蛋白，它屬于氯通道蛋白家族中的一種，最近研究表明CLIC1在肝癌、膽囊癌和胃癌等腫瘤組織中高表達(dá)，并與膽囊癌及胃癌的轉(zhuǎn)移

2、相關(guān)，在結(jié)直腸癌中也檢測到CLIC1的高表達(dá)，但是CLIC1是否與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)未作相關(guān)研究。因此本課題從以下三個(gè)方面對CLIC1與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移作一初步研究：
　　 (1)CLIC1在結(jié)腸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)有無差異，CLIC1的表達(dá)結(jié)腸癌患者與患者的性別、年齡、腫瘤大小、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等是否有關(guān)；
　　 (2)CLIC1能否通過調(diào)控性容積下降(RVD)介導(dǎo)結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移；
　　 (3)CLIC

3、1在缺氧-再加氧條件下與結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移及其機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的防治提供新的思路和方法。
　　 研究方法與結(jié)果：
　　 第一部分 CLIC1mRNA及蛋白在結(jié)腸癌表達(dá)及臨床意義
　　 方法：收集2011年1-6月本院手術(shù)切除的54例結(jié)腸癌和相應(yīng)癌旁組織(距腫瘤邊緣>5cm)標(biāo)本。采用逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測CLIC1mRNA在結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)情況，免疫組化檢測CLIC1蛋白在結(jié)腸癌組織的表達(dá)。比較CLIC

4、1mRNA在結(jié)腸癌及癌旁組織的表達(dá)差異，分析CLIC1蛋白的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期等方面的關(guān)系。
　　 結(jié)果：CLIC1mRNA在54例患者癌組織中表達(dá)的陽性率為85.18％(46/54)；在相應(yīng)癌旁組織中表達(dá)的陽性率為90.74％(49/54)，兩者CLIC1mRiNA的陽性表達(dá)率之間比較無明顯差異(P>0.05)。CLIC1mRNA在結(jié)腸癌及癌旁組織中的擴(kuò)增水平別為0.657

5、6±0.04.3和0.2808±0.027，兩者比較P<0.01。結(jié)腸癌組織中CLIC1蛋白的表達(dá)水平高于癌旁組織，CLIC1蛋白表達(dá)在患者腫瘤的浸潤程度(P<0.05)和有無淋巴轉(zhuǎn)移(P<0.05)存在差異；在TNM分期(P<0.01)差異有顯著性；而CLIC1蛋白表達(dá)在患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度方面無明顯差異(P>0.05)。
　　 第二部分 CLIC1介導(dǎo)RVD促進(jìn)結(jié)腸癌遷移及侵襲
　　 方法：我

6、們用人結(jié)腸癌細(xì)胞株LOVO和HT29作為細(xì)胞模型來研究氯離子通道蛋白-1(CLIC1)在結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中的作用。用低滲液分別刺激誘導(dǎo)LOVO和HT29細(xì)胞的調(diào)控性細(xì)胞容積下降(RVD)過程，比較兩者RVD的差異；然后CLIC1特異性抑制劑IAA94觀察對LOVO和HT29細(xì)胞RVD的影響。分別采用CLIC1特異性抑制劑IAA94和CLIC1SiRNA轉(zhuǎn)染，研究它們對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移及侵襲的影響。通過RT-PCR、Western Blot及細(xì)胞

7、免疫熒光檢測CLIC1 mRNA及其蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：當(dāng)兩種細(xì)胞暴露于低滲溶液時(shí)，高轉(zhuǎn)移潛能的LOVO和低轉(zhuǎn)移潛能的HT29細(xì)胞細(xì)胞，與在等滲溶液中比較細(xì)胞容積分別增J31145.6±1.8％(P<0.01)和46.8±2.3％(P<0.01)。在腫脹高峰后，細(xì)胞容積逐漸下降。LOVO細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞容積從峰值145.6±1.8％(低滲5分鐘)，下降至最小值109.8±3.0％(低滲17分鐘)(P<0.01)；HT29細(xì)胞

8、標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞容積，從峰值146.8±2.3％(低滲5分鐘)，在低滲16分鐘下降至最小值120.5±2.1％(低滲16分鐘)(P<0.01)。HT29和LOVO細(xì)胞的RVD值分別為61.4±2.2％和81.09±1.9％，兩者比較差異有顯著性(P<0.01)。特異的氯離子通道蛋白-1阻滯劑IAA94(20或40μmol/L)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的RVD、遷移和侵襲能力。這些效應(yīng)呈劑量依賴性。小RNA(SiRNA)干擾下調(diào)CLIC1的表達(dá)亦可抑制

9、LOVO和HT29細(xì)胞的遷移和侵襲能力。CLIC1蛋白均主要表達(dá)在兩種類型細(xì)胞的細(xì)胞膜，表明可發(fā)揮氯離子通道功能；與HT29細(xì)胞相比，CLIC1mRNA和蛋白的表達(dá)在LOVO細(xì)胞均高表達(dá)(P<0.01)。氯離子通道蛋白-1特異阻滯劑IAA94(20或40μmol/L)對兩種細(xì)胞的CLIC1mRNA和蛋白表達(dá)水平均無明顯的影響。
　　 第三部分 CLIC1通過ROS/ERK信號(hào)通路介導(dǎo)結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞的遷移及侵襲
　　

10、方法：缺氧-再加氧(H-R)培養(yǎng)處理人結(jié)腸癌LOVO細(xì)胞，熒光探針DCF-DA檢測檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，傷口愈合及Transwell細(xì)胞侵襲試驗(yàn)分別檢測對LOVO細(xì)胞遷移及侵襲的影響。NADPH氧化酶抑制劑(DPI)、抗氧化劑(NAC)、ERK抑制劑(PD98059)及氯離子通道蛋白-1抑制劑(IAA94)分別處理H-R條件下LOVO細(xì)胞，檢測對細(xì)胞ROS產(chǎn)生、遷移及侵襲的影響，Western blot檢對ERK、p-ERK、

11、MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：與常氧培養(yǎng)組(N)比較，H-R處理后LOVO細(xì)胞內(nèi)的ROS明顯提高(P<0.01)，細(xì)胞的遷移及侵襲能力明顯增強(qiáng)(分別P<0.05，P<0.01)，P-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。與H-R組比較，DPI(15μmol/L)組；NAC(30mmol/L)組；PD98059(50μmol/L)組或IAA94(20和40μmol/L)組細(xì)胞ROS產(chǎn)生、遷移及侵

12、襲能力明顯減弱(P<0.01)，p-ERK、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平亦明顯減少。
　　 全文結(jié)論：
　　 (1)CIAC1mRNA及其蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，CLIC1蛋白表達(dá)在腫瘤的浸潤程度、有無淋巴轉(zhuǎn)移和TNM分期方面存在顯著差異；而在患者的年齡、性別、腫瘤的大小、部位、分化程度方面差異無顯著性。
　　 (2)RVD與結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能有關(guān)；CLIC1特異性抑制劑IAA94抑制結(jié)腸癌LOVO及H