神經(jīng)酰胺對高糖培養(yǎng)的人臍靜脈內皮細胞PKB-eNOS信號通路的影響及機制研究.pdf

1、目的:
　　本研究旨在明確:1、觀察高糖培養(yǎng)的血管內皮細胞神經(jīng)酰胺及NO的濃度變化;2、神經(jīng)酰胺是否與高糖引起的血管內皮細胞胰島素IRS-1/PI3K/PKB(Akt)/eNOS信號通路的下調有關;3、抑制神經(jīng)酰胺的合成能否改善高糖引起的/PKB/eNOS的活性降低以及內皮功能的紊亂;4、抑制神經(jīng)酰胺降解是否加重血管內皮細胞PKB/eNOS信號通路抑制，使NO的合成減少。
　　方法:
　　1、實驗分組:
　　(1

2、)低濃度(5mM)和高濃度（30 mM）D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs4、8、12、16和24小時對細胞內神經(jīng)酰胺及NO濃度的影響;
　　(2)不同濃度5、10、20、30 mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細胞16小時后，細胞內神經(jīng)酰胺及NO濃度的變化;
　　(3)不同濃度(5、10、20、30 mM) D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細胞給予50nM胰島素刺激后，測定細胞內NO濃度的變化;
　　(4)30mM D-葡萄糖培養(yǎng)

3、HUVECs細胞16小時，測定內皮細胞上IRS-1、PI3K、Akt、eNOS蛋白表達及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化;
　　(5)分別給予神經(jīng)酰胺合成途徑的特異性抑制劑50μM Myriocin或2.μM DES后，測定30mM D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細胞內神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化;
　　(6)分別給予抑制神經(jīng)酰胺降解途徑的特異性抑制劑150μMNOE或5

4、0μM PDMP后，測定30mM D-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細胞內神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化;
　　(7)給予30mMD-葡萄糖培養(yǎng)的HUVECs細胞50nM胰島素刺激后，分別加入50μM Myriocin、2μM DES、150μM NOE或50μM PDMP，測定細胞內神經(jīng)酰胺濃度、Akt、eNOS蛋白表達及Akt、eNOS磷酸化蛋白的變化和NO的變化。
　　2

5、、方法:
　　采用高濃度D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs;液相色譜-質譜聯(lián)用法測定細胞神經(jīng)酰胺濃度;Western blot法檢測血管內皮細胞中IRS-1，PI3K，Akt和eNOS表達;重氮還原法測定NO合成。
　　結果:
　　1.和低糖組相比，高糖組（30mM D-葡萄糖）培養(yǎng)的HUVECs內皮細胞內神經(jīng)酰胺濃度隨時間的延長呈逐漸增加的趨勢，在16小時時神經(jīng)酰胺濃度達最高值，NO濃度隨時間延長呈逐漸遞減的趨勢，在24小時

6、降低最明顯;高糖組培養(yǎng)的HUVECs細胞內神經(jīng)酰胺的濃度的升高和NO濃度減少具有時間依賴性(P＜0.05)，L-葡萄糖對血管內皮細胞神經(jīng)酰胺濃度無顯著影響(p＞0.05)。
　　2.與低糖組相比較，10、20、30mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細胞均能引起細胞內神經(jīng)酰胺濃度的增加和NO水平的下降(p＜0.05)，內皮細胞內神經(jīng)酰胺的積聚和NO濃度下降具有濃度依賴性(p＜0.05)。
　　3.50nM胰島素培養(yǎng)HUVECs細

7、胞4、8、12、16小時，NO濃度顯著升高，在4小時NO濃度達到最高值后呈下降趨勢，24小時NO濃度降至最低。50nM胰島素刺激16小時，10mM、20 mM和30 mM D-葡萄糖培養(yǎng)HUVECs細胞NO濃度均顯著下降，NO濃度與D-葡萄糖濃度成反比。
　　4.給予HUVECs細胞50nM胰島素刺激16小時后，IRS-1、PI3K、PKB、eNOS蛋白表達水平增高;與低糖組相比，高糖抑制PKB、eNOS磷酸化蛋白的表達，高糖對P

8、KB、eNOS總蛋白表達無影響(p＜0.05)。
　　5.神經(jīng)酰胺基礎合成阻斷劑Myriocin或DES可以阻斷高糖誘導的細胞神經(jīng)酰胺積聚，改善高糖對胰島素信號傳導的抑制和內皮功能的紊亂。增加PKB、 eNOS磷酸化蛋白表達，使NO的濃度升高(p＜0.05)。
　　6.神經(jīng)酰胺降解阻斷劑NOE或PDMP能使血管內皮細胞神經(jīng)酰胺濃度增加，NOE使高糖引起的PKB、eNOS磷酸化蛋白表達下降更明顯，同時降低NO的濃度(p＜0.0

9、5)。
　　結論:
　　1、高糖誘導人臍靜脈血管內皮細胞神經(jīng)酰胺的積聚，神經(jīng)酰胺濃度的增高具有時間依賴性和濃度依賴性; L-葡萄糖對人臍靜脈血管內皮細胞神經(jīng)酰胺濃度無顯著影響;
　　2、高糖可以抑制人臍靜脈血管內皮細胞胰島素PKB/eNOS信號通路的傳導和引起內皮功能的紊亂;神經(jīng)酰胺可能介導了高糖引起的血管內皮細胞功能紊亂;
　　3、神經(jīng)酰胺合成途徑的特異性抑制劑myriocin和DES可阻斷高糖誘導的人臍靜脈血