法國梧桐花粉變應(yīng)原Plaa1的克隆表達(dá).pdf

1、目的：法國梧桐花粉是我國西南和南方很多地區(qū)春季播散的重要花粉變應(yīng)原之一，可引起蕁麻疹、過敏性鼻炎及哮喘等變態(tài)反應(yīng)性疾病。 本研究擬通過克隆法國梧桐花粉主要變應(yīng)原(Platanus acerifolia pollen 1)Pla al基因構(gòu)建其原核表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，并鑒定該重組花粉主要變應(yīng)原Pla al表達(dá)蛋白，為以后大量獲得重組Pla al變應(yīng)原用于花粉變應(yīng)性疾病的臨床診治奠定基礎(chǔ)。同時也為深入研究法國梧桐花粉主要過敏原Pla

2、al與變態(tài)反應(yīng)性疾病的關(guān)系以及在臨床診療中研發(fā)新的脫敏制劑奠定基礎(chǔ)。 方法：采用CTAB法提取法國梧桐花粉總RNA及葉片基因組總DNA，用Vector NTI Advance 9.0軟件分析序列和輔助設(shè)計PCR引物。采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和Oligo dT引物反轉(zhuǎn)錄法國梧桐花粉總RNA，得到總cDNA第一鏈；以此為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增Pla al基因全長cDNA以及不含信號肽的編碼區(qū)。將模板替換為基因組總DNA以后，

3、同樣條件下擴(kuò)增與全長cDNA對應(yīng)的全長基因組序列。瓊脂糖凝膠電泳檢測后，特異PCR條帶采用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化，并與pMD 18-T載體進(jìn)行連接重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，涂含Amp+IPTG+X-gal的LB平板后，挑取白斑克隆子進(jìn)行LB+Amp液體培養(yǎng)，PCR鑒定為陽性的克隆子菌液采用通用引物M13F/M13R引物進(jìn)行測序。序列分析在Vector NTI Advance 9.0和NCBI網(wǎng)站進(jìn)行。采用Sph I+Sa

4、l I雙酶切，將Pla al不含信號肽的編碼區(qū)片段(P1a a1E)從重組T載體(pMD18-T-P1a a1E)上切下后回收，與同樣酶切開環(huán)的pQE-30線狀空載體采用T4 DNA連接酶進(jìn)行16℃連接12h，得到重組原核表達(dá)載體pQE-30-P1a a1E，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15感受態(tài)細(xì)胞，挑取抗氨芐青霉素和卡那霉素的陽性菌落進(jìn)行同樣雙抗生素液體培養(yǎng)，菌液PCR鑒定為陽性的克隆子進(jìn)一步提取質(zhì)粒，采用Sph Ⅰ+Sal Ⅰ雙酶切鑒定。陽性克

5、隆子液體培養(yǎng)后采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，同時用未誘導(dǎo)表達(dá)作對照，采用SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)結(jié)果。 結(jié)果：通過RT-PCR從法國梧桐花序總cDNA中擴(kuò)增出了P1a a1基因的全長cDNA，與已報道序列基本一致，但發(fā)現(xiàn)該基因在非編碼區(qū)存在SNP位點(diǎn)，尤其是在起始密碼子ATG之前的Oligo A序列存在長度多態(tài)性。本研究還克隆了一條與P1a a1高度同源的新基因P1a a1'的大部分編碼區(qū)序列。以基因組DNA為模板的對比克隆表明

6、該基因沒有內(nèi)含子?？寺∽泳篜CR和質(zhì)粒酶切圖譜鑒定均表明，pQE-30-P1a a1 E構(gòu)建成功。IPTG誘導(dǎo)的含有pQE-30-P1a a1E的大腸桿菌M15菌液表達(dá)的具有6×His標(biāo)簽的蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳成功地顯示了一條約16kD的條帶，與預(yù)測分子量一致，對照無此條帶，說明原核表達(dá)成功，但誘導(dǎo)6h與4h間差異不明顯。 結(jié)論： 1)發(fā)現(xiàn)了法國梧桐花粉主要變應(yīng)原P1a，a1基因的SNP多態(tài)性位點(diǎn)。 2