鈣蛋白酶抑制劑和前胡丙素對缺血再灌注心肌肌漿網(wǎng)鈣泵的作用及機制.pdf

1、目的：心肌缺血/再灌注(Ischcmia-reperfusion,I/R)損傷是指心肌血供中斷一定時間后再恢復(fù)血液供應(yīng),原缺血心肌發(fā)生較血液供應(yīng)恢復(fù)前更嚴(yán)重的損傷。細(xì)胞內(nèi)鈣超載是心肌缺血/再灌注損傷的主要原因之一,而肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum,SR)在維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)方面起重要作用,因此由于鈣超載而激活的鈣蛋白酶(Calpain)對肌漿網(wǎng)蛋白的降解作用可能是缺血/再灌注損傷的一種機制。本文旨在研究Calpain

2、抑制劑(N-Acetyl-L-leucyl-L-leucyl-L-norleucinal,ALLN)和前胡丙素(praeruptorin C,pra-c)對缺血/再灌注大鼠心肌肌漿網(wǎng)鈣泵(sarcoplasmic reticulum ca2+-ATPase,SERCA)的影響,進一步揭示心肌缺血/再灌注損傷作用機制和前胡丙素抗損傷的保護機制。 方法： 1.建立Langendorff離體心臟灌注模型,并將99只雄性SD大鼠

3、隨機分為control組,I/R組,ALLN+control組,ALLN+I/R組,pra-c+I/R組,ALLN+pra-c+I/R組,ALLN+H-89(PKA特異性抑制荊)+I/R組,pra-c+H-89+I/R組,ALLN+pra-c+H-89+I/R組,二甲亞砜(Dimethyl stlfoxide,DMSO)+I/R組和聚乙二醇400(polyethylene glycol 400,PEG400)+I/R組。 2.分

4、別檢測再灌注15分鐘時冠脈流量(coronary flow,CF)和冠脈流出液中LDH漏出量。 3.實驗結(jié)束后,每組隨機取3枚心臟,膠原酶I分離心肌細(xì)胞,后分別予FLUO-3/AM和Annexin-V/PI熒光染色劑負(fù)載細(xì)胞,利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)鈣熒光強度和細(xì)胞凋亡率,并計算凋亡指數(shù)。 4.再灌注結(jié)束后,低溫超速離心制備心肌肌漿網(wǎng)。 5.熒光分光光度計測定AMC(7-Amino-4-methylcoumari

5、n)熒光強度來反映Calpain活性。 6.免疫印跡法檢測心肌細(xì)胞Calpain和肌漿網(wǎng)鈣泵蛋白表達量。 7.分別采用改良p-NPP法和Millipore過濾技術(shù)測定肌漿網(wǎng)鈣泵的活性和ATP依賴的SR45Ca2+攝取率。 結(jié)果：同control組相比,I/R組CF、肌漿網(wǎng)鈣泵蛋白表達量、肌漿網(wǎng)鈣泵的活性和45SCa2+攝取率顯著降低(P<0.05),LDH、Calpain活性和蛋白表達量、胞內(nèi)鈣熒光強度和細(xì)胞凋亡

6、指數(shù)均顯著升高(P<0.05)。同I/R組相比,若在缺血前預(yù)先使用10μmol/L ALLN、100μmol/L前胡丙素或同時使用10μmol/L ALLN和100μmol/L前胡丙素,則CF、肌漿網(wǎng)鈣泵蛋白表達量、肌漿網(wǎng)鈣泵的活性和45Ca2+攝取率顯著增高(P<0.05),LDH、Calpain活性和蛋白表達量、胞內(nèi)鈣熒光強度和細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低(P<0.05),且三組之間各項指標(biāo)均無統(tǒng)計學(xué)差異,但這些作用(除Calpain蛋白

7、表達量外)均可被10μmol/L PKA抑制劑H-89所阻斷。 結(jié)論： 1.Calpain抑制劑(ALLN)和前胡丙素對離體心臟缺血/再灌注損傷具有相似的保護作用,可以減輕缺血/再灌注損傷所致的細(xì)胞內(nèi)鈣超載和細(xì)胞凋亡,其作用與抑制Calpain活性和Calpain蛋白表達量有關(guān)。 2.Calpain抑制劑(ALLN)和前胡丙素均可一定程度恢復(fù)缺血/再灌注損傷對心肌肌漿網(wǎng)鈣泵功能和蛋白表達量的影響,且兩者保護程度相