電針治療大鼠胃潰瘍模型的效應(yīng)與肥大細(xì)胞的相關(guān)性研究.pdf

1、根據(jù)中醫(yī)經(jīng)絡(luò)學(xué)說,耳為宗脈之所聚,六陽經(jīng)都直接或間接地上耳前或耳中,六陰經(jīng)則通過與陽經(jīng)的絡(luò)屬關(guān)系,間接地與耳發(fā)生聯(lián)系。臟腑的生理或病理活動(dòng)均可通過經(jīng)絡(luò)反映于耳。足三里是胃經(jīng)的合穴,也是下合穴,“合治內(nèi)府”,是治療胃腑病的常用首選穴位,具有和胃健脾,降逆調(diào)中之功。大量臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察均證實(shí)針刺“耳胃”穴及“足三里”穴對(duì)胃潰瘍有明顯療效。但其治療的作用機(jī)理至今尚未甚明,以致影響防治效果。
　　 目的:研究電針“耳胃”及“足三里”穴

2、治療實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍過程中,穴區(qū)肥大細(xì)胞(mast cells,MCs)和腹腔MCs(Peritoneal MCs,PMCs)的功能變化與療效的相關(guān)性。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)均采用清潔級(jí)Wistar大鼠,雌雄各半,由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
　　 ①形態(tài)學(xué)及電生理學(xué)實(shí)驗(yàn):將40只大鼠(體重150-220g)隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、電針組和模型測導(dǎo)電量組(簡稱導(dǎo)電量組)。后3組首先采用1ml注射器在胃竇前壁肌層與漿膜層之間

3、注入0.05ml20％冰醋酸的方法制作胃潰瘍模型。電針組動(dòng)物在手術(shù)后4h電針(2/15HZ,1mA,30min)雙側(cè)“耳胃”穴和“足三里”穴,電針前用HB-EDT-A穴位診斷治療儀(河北威海醫(yī)用電子儀器有限公司)測定1次“耳胃”穴導(dǎo)電量,然后隔2h再測定1次。以后每天電針前測定1次,至造模后7d。導(dǎo)電量組大鼠在胃潰瘍造模術(shù)后不進(jìn)行電針,但耳穴測定與電針組同時(shí)進(jìn)行。7天后分別取4組大鼠“耳胃”及“足三里”穴區(qū)組織恒冷箱切片,乙酰膽堿酯酶(

4、acetylcholinesterase,AchE)組化染色并用甲苯胺蘭(toluidine blue,TB)復(fù)染,顯示穴區(qū)真皮至皮下組織MCs的分布、數(shù)量和脫顆粒情況。取胃竇前壁含潰瘍胃組織石蠟包埋,切片后行蘇木精一伊紅(hemotoxylin-eosin,HE)染色。
　　 ②PMCs的收集和培養(yǎng)及流式細(xì)胞儀檢測:
　　 a PMCs的收集及離心:40只大鼠(體重約200g)經(jīng)麻醉,腹部去毛,消毒后,切開腹部,在無菌

5、條件下收集腹腔沖洗液,并離心(1000r/min,4℃)10min,棄上清液,取其細(xì)胞懸液,沿管壁緩慢加入盛有PMCs分離液的離心管中,使兩液形成界面,然后離心(2500r/min,4℃)15min,棄上清液,取底部PMCs,用冷的無Ca2+、Mg2+的PBS離心清洗2次(1000r/min4℃)共20min,棄上清液。
　　 b PMCs的培養(yǎng)和血清的制備:取底部PMCs,TB染色,光鏡下計(jì)數(shù),調(diào)PMCs濃度至106個(gè)/ml,

6、PMCs純度大于95％以上,臺(tái)盼藍(lán)染色,活力大于95％,并置于含10％小牛血清的RPMI-1640孵育液中懸浮備用
　　 將30只大鼠(體重約200g)隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和電針組(3組大鼠的相應(yīng)處理均按照形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中的方法,但電針組不再測耳穴導(dǎo)電量),7天后分別在3組大鼠的頸動(dòng)脈取血,將血液移入離心管中,37℃下靜置2h,在常溫下離心(2500r/min)10min,用吸管小心吸取血清,將同組血清混合,過濾除菌,分裝后-20

7、℃凍存?zhèn)溆谩?br>　　 c PMCs脫顆粒率的流式細(xì)胞儀分析:在PMCs懸液中,分別加入3組大鼠的血清(PMCs懸液與血清之比為1:1),置37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共孵育2h,4℃終止反應(yīng),用冷的無Ca2+、Mg2+的PBS離心清洗2次(1000r/min4℃)共10min,棄上清液,取底部PMCs,用100μl Anncxin-V熒光標(biāo)記液(1ml孵育緩沖液+20μlAnncxin-V熒光標(biāo)記素+20μl Propidium碘化

8、液)懸浮,并在15-25℃孵育10-15min,采用ELITE-型流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)Annexin V熒光陽性細(xì)胞數(shù)(即為PMCs的脫顆粒率)。
　　 結(jié)果:
　　 ①形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn):對(duì)4組大鼠的穴區(qū)真皮至皮下組織MCs進(jìn)行對(duì)比觀察,其中模型組MCs總數(shù)量均明顯多于導(dǎo)電量組、電針組和對(duì)照組,導(dǎo)電量組MCs總數(shù)量又明顯多于電針組和對(duì)照組,電針組又多于對(duì)照組。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示,4組間存在非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,

9、P<0.01)。通過對(duì)各組穴區(qū)內(nèi)MCs脫顆粒率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理,結(jié)果表明模型組MCs脫顆粒率明顯高于導(dǎo)電量組、電針組和對(duì)照組,導(dǎo)電量組細(xì)胞脫顆粒率也明顯高于電針組和對(duì)照組,電針組高于對(duì)照組,且4組間均存在非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。
　　 HE染色結(jié)果顯示:對(duì)照組胃竇前壁粘膜面完整無缺損；而模型組胃竇前壁粘膜面有很明顯的潰瘍?nèi)睋p,已明顯超過粘膜肌層；電針組胃竇前壁粘膜面稍有缺損,尚未達(dá)粘膜肌層；導(dǎo)電

10、量組胃竇前壁粘膜面的潰瘍?nèi)睋p介于模型組與電針組之間。
　　 ②電生理學(xué)實(shí)驗(yàn):導(dǎo)電量組及電針組大鼠術(shù)后“耳胃”穴導(dǎo)電量皆較手術(shù)前顯著升高,電阻值降低。但電針組于第1次電針后導(dǎo)電量即不再升高,維持在術(shù)后第1次測定的水平；導(dǎo)電量組大鼠術(shù)后耳穴導(dǎo)電量卻繼續(xù)升高,并持續(xù)3～5天,第6天后開始下降；兩組的耳穴導(dǎo)電量升高從第1次電針后即表現(xiàn)出組間顯著性差異,第7天后才逐漸接近。
　　 ③PMCs脫顆粒率的流式細(xì)胞儀檢測:模型血清組PM

11、Cs的脫顆粒率明顯高于電針血清組和對(duì)照血清組,電針血清組PMCs的脫顆粒率明顯高于對(duì)照血清組,統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果顯示3組間均有非常顯著性差異(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 ①在穴區(qū)MCs較多,并多沿神經(jīng)和血管分布,特別在小血管周圍較密集,說明MCs確實(shí)與穴位反應(yīng)和針刺效應(yīng)相關(guān)。
　　 ②相關(guān)穴區(qū)MCs數(shù)量及脫顆粒率的變化與實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的發(fā)生呈正相關(guān)性,這為體表臟腑相關(guān)的理論提供實(shí)驗(yàn)