補(bǔ)腎調(diào)沖方對(duì)環(huán)磷酰胺致DOR小鼠卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎發(fā)育潛能的影響.pdf

1、目的：
　　本實(shí)驗(yàn)以國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（批準(zhǔn)號(hào)：81273791）為依托進(jìn)行設(shè)計(jì)。采用環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，Cy）腹腔注射法建立卵巢儲(chǔ)備功能下降（Diminished ovarian reserve，DOR）小鼠模型。研究Cy對(duì)DOR小鼠卵巢獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞成熟率、受精率及囊胚形成率的影響。在此基礎(chǔ)上探討補(bǔ)腎調(diào)沖方改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和提高胚胎發(fā)育潛能的作用機(jī)制。為臨床治療DOR提供新的方法，并為中醫(yī)學(xué)“腎

2、主生殖”及“沖任學(xué)說(shuō)”提供新的理論依據(jù)。
　　方法：
　　健康雌性ICR小鼠40只，隨機(jī)分為4組，分別為A：空白組B：模型組C：中藥組D：DHEA組，每組n=10。B、C、D三組每只小鼠一次性腹腔注射環(huán)磷酰胺75mg/kg造模。造模后 A組、B組每日給予生理鹽水12mg/kg灌胃；C組每天給予補(bǔ)腎調(diào)沖方20mg/kg灌胃；D組每天給予DHEA15mg/kg溶液灌胃，連續(xù)給藥4周。四周后，麻醉后斷頭處死小鼠獲取成熟卵母細(xì)胞，健

3、康雄性昆明種小白鼠剪碎附睪尾取精，精卵體外受精培養(yǎng)。囊胚形成后將囊胚移入假孕2.5天的ICR小鼠的子宮中，分別在植入6.5天、17.5天及出生后進(jìn)行觀察。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)包括：Cy造模后顯微鏡下觀察各組小鼠的成熟卵母細(xì)胞數(shù)目；采用免疫熒光結(jié)合共聚焦顯微鏡技術(shù)，觀察各組小鼠成熟卵母細(xì)胞線(xiàn)粒體、紡錘體、微管的分布；應(yīng)用Realtime RT-PCR方法，檢測(cè)各組小鼠卵母細(xì)胞成熟相關(guān)因子的基因表達(dá)水平；用Real-time RT-PCR及Wes

4、tern blot方法，檢測(cè)各組小鼠卵母細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞上BDNF及其受體TrkB基因與蛋白的表達(dá)水平；并用直接熒光蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) MAPK信號(hào)通路上關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平；受精后檢測(cè)卵母細(xì)胞受精情況、2-細(xì)胞及囊胚形成率，用 TUNEL方法記錄凋亡情況。囊胚植入6.5天的時(shí)候，每組解剖6只，觀察懷孕率和植入率，在17.5天的時(shí)候，觀察出生率。出生一周后，檢測(cè)出生體重，胎盤(pán)重量。
　　結(jié)果：
　　1.各組小鼠獲卵數(shù)比較：從

5、獲得卵團(tuán)數(shù)量看，空白組顯著高于其他三組，中藥組數(shù)目高于模型組和DHEA組。從每個(gè)小鼠的獲卵總數(shù)和MII期卵母細(xì)胞數(shù)看，空白組顯著高于模型組，中藥組和DHEA組，而中藥組和DHEA組顯著高于模型組。從不成熟卵母細(xì)胞和其它類(lèi)型卵母細(xì)胞的數(shù)量看，模型組顯著高于其他三組，其他三組之間沒(méi)有顯著差異。
　　2.各組小鼠成熟卵泡質(zhì)量比較：空白組中線(xiàn)粒體拷貝數(shù)顯著高于其他三組，而中藥組和DHEA組顯著高于模型組。從線(xiàn)粒體定位看，模型組中多數(shù)IVM

6、卵母細(xì)胞的線(xiàn)粒體仍然呈現(xiàn)中央聚集的現(xiàn)象，比例顯著高于其他三組，而這三組之間沒(méi)有顯著差異。從紡錘體組裝看，模型組紡錘體異常率顯著高于其他三組，其他三組之間并沒(méi)有顯著差異。
　　3.各組小鼠卵細(xì)胞成熟相關(guān)因子表達(dá)的比較：空白組與中藥組比較，各基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異；空白組與中藥組顯著高于模型組和DHEA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；且模型組與DHEA組比，模型組顯著低于DHEA組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.各組小鼠BDNF信號(hào)轉(zhuǎn)

7、導(dǎo)通路相關(guān)因子表達(dá)的比較：BDNF及其受體基因的表達(dá)在A、C和D組的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中顯著升高，在B組中顯著降低。而顆粒細(xì)胞的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相似的表達(dá)趨勢(shì)。在A，C和D組中，MAPK信號(hào)通路中P38表達(dá)下降，磷酸化水平升高。JNK表達(dá)沒(méi)有顯著改變。
　　5.各組小鼠卵母細(xì)胞的受精率及囊胚形成率比較：受精率：模型組小鼠顯著低于其他三組，而DHEA組顯著低于空白組，空白組和中藥組之間沒(méi)有顯著差異。2細(xì)胞率：空白組與中藥組沒(méi)有顯著差異，

8、顯著高于模型組和DHEA組，而DHEA組又顯著高于模型組。囊胚率：空白組顯著高于模型組和DHEA組，而模型組顯著低于其他三組，中藥組與空白組和DHEA組相比較都沒(méi)有顯著差異。囊胚質(zhì)量：空白組胚胎的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)與滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)顯著高于其他三組，而中藥組的滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)顯著高于DHEA組，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)兩組之間沒(méi)有顯著差異。模型組囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)均顯著低于其他三組。
　　6.植入及胎兒出生率比較：從植入率看，模型組顯著低于其他三組。從出

9、生率看，模型組同樣顯著低于其他三組，而DHEA組顯著低于空白組和中藥組，中藥組顯著低于空白組。胎盤(pán)重量在空白組，中藥組和DHEA組之間沒(méi)有顯著差異，DHEA組小鼠胎盤(pán)重量有降低的趨勢(shì)，而模型組胎盤(pán)重量顯著低于其他三組。
　　結(jié)論：
　　1.環(huán)磷酰胺可致大鼠卵巢組織受損，卵泡數(shù)目減少，成熟率降低，凋亡細(xì)胞增多，提示DOR小鼠造模成功。
　　2.補(bǔ)腎調(diào)沖方能夠增加DOR小鼠的獲卵數(shù)，成熟卵母細(xì)胞數(shù)，及提高卵母細(xì)胞成熟相關(guān)因

10、子的表達(dá)。
　　3.補(bǔ)腎調(diào)沖方上調(diào)卵母細(xì)胞及卵丘顆粒細(xì)胞中BDNF及其受體TrkB基因與蛋白的表達(dá)；下調(diào)MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白P38的磷酸化水平，推測(cè)補(bǔ)腎調(diào)沖方促進(jìn)卵泡生長(zhǎng)分化，減少凋亡是通過(guò)BDNF及MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)的。
　　4.補(bǔ)腎調(diào)沖方能夠提高DOR小鼠的受精率、囊胚形成率及胎兒出生率。推測(cè)補(bǔ)腎調(diào)沖方通過(guò)提高卵母細(xì)胞質(zhì)量而提高胚胎發(fā)育潛能。
　　5.中藥在治療DOR進(jìn)而提高輔助生殖技術(shù)成功率及妊娠結(jié)局方