炎癥通過LDLr途徑致ApoE-SRA-CD36三敲小鼠膽固醇在體內(nèi)重新分布及組織損害的分子機制.pdf

1、第一部分：
　　 目的:采用酪蛋白刺激ApoE/SRA/CD36三敲小鼠建立炎癥模型,模擬人體內(nèi)低豐度慢性系統(tǒng)性炎癥,并進行體內(nèi)實驗,探討炎癥狀態(tài)下,脂質(zhì)代謝的變化和組織損害及其分子機制。
　　 方法:16只雄性ApoE/SRA/CD36三敲小鼠隨機分為兩組:對照組(n=8)和炎癥組(n=8)。兩組小鼠均喂食西方飲食(Western diet,TD88137,含21％脂肪和0.15％膽固醇)。對照組小鼠皮下注射0.5ml

2、PBS,炎癥組小鼠皮下注射相同量的酪蛋白,隔天注射一次,持續(xù)14周后,處死小鼠,收集血漿、肝臟、腎臟和主動脈組織。血漿離心去血清,檢測其中炎癥介質(zhì)一小鼠血清淀粉樣蛋白(serum arnyloid A,SAA)和IL-6-的水平。
　　 結(jié)果:與對照組小鼠相比,炎癥組小鼠體內(nèi)SAA和IL-6水平明顯升高,分別為26.60±3.24ng/ml vs14.35±1.73ng/ml(P<0.01),36.37±2.20pg/rrd v

3、s18.02±4.87 pg/ml(P<0.01),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:隔天小鼠皮下注射10％酪蛋白,持續(xù)14周,小鼠體內(nèi)產(chǎn)生低豐度慢性系統(tǒng)性炎癥,炎癥模型建立成功。
　　 第二部分：
　　 目的:研究低豐度慢性系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)下,ApoE/SRA/CD36三敲小鼠血清、肝臟、腎臟和主動脈脂質(zhì)水平的變化,以及肝臟纖維化相關(guān)指標(biāo)的水平,觀察炎癥致脂代謝紊亂和組織損害的程度。
　　 方法:用試劑盒法

4、測定血清脂質(zhì)水平,包括總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。一部分肝臟、腎臟和主動脈組織包埋于OCT膠制作冰凍切片,一部分肝臟和腎臟組織經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟切片。用油紅O法染色冰凍切片觀察肝臟、腎臟和主動脈脂質(zhì)沉積的情況；用酶法測定肝臟和腎臟組織中膽固醇的含量；測量并計算主動脈根部斑塊總面積與血管周長的比例。用免疫組織化學(xué)染色法和Real Time PCR方法檢測小鼠肝臟和腎臟組織中Ⅰ型膠原(Co

5、l-Ⅰ)、Ⅳ型膠原(Col-Ⅳ)、纖維連接蛋白(Fn)蛋白和mRNA的表達。
　　 結(jié)果:①在脂代謝紊亂方面,血清脂質(zhì)檢測表明炎癥組小鼠血清中TC、LDL和HDL水平降低,明顯低于對照組小鼠,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；油紅O染色結(jié)果顯示,炎癥組小鼠肝臟、腎臟和主動脈斑塊內(nèi)有大量的紅染顆粒,脂質(zhì)沉積異常增多；細胞內(nèi)膽固醇測定結(jié)果顯示,相對于對照組,炎癥組小鼠肝臟和腎臟組織中膽固醇含量顯著增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05

6、)；統(tǒng)計主動脈根部斑塊面積與血管周長比例的數(shù)據(jù)表明,炎癥組小鼠斑塊面積和脂質(zhì)含量都明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②組織損害方面,HE染色顯示肝臟和腎臟組織結(jié)構(gòu)有病變；免疫組織化學(xué)染色觀察炎癥組小鼠肝臟和腎臟Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Fn蛋白表達與對照組相比,沒有明顯增多,但Real Time PCR測定表明炎癥組小鼠肝臟Col-Ⅰ、Col-Ⅳ、Fn mRNA的表達高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　

7、　 結(jié)論:低豐度慢性系統(tǒng)性炎癥造成ApoE/SRA/CD36三敲小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂,炎癥組小鼠血脂水平降低,而肝臟、腎臟和主動脈脂質(zhì)沉積加重,膽固醇在體內(nèi)重新分布；炎癥導(dǎo)致肝臟和腎臟組織損傷,可能啟動了肝臟和腎臟纖維化病變。
　　 第三部分：
　　 目的:通過對低密度脂蛋白受體(LDL receptor,LDLr)途徑中核轉(zhuǎn)錄因子膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP)裂解激活蛋白(SCAP)、SREBP-2和LDOLr

8、蛋白和mRNA表達的檢測,探究炎癥致ApoE/SRA/CD36三敲小鼠體內(nèi)膽固醇重新分布和組織損傷的分子機制。
　　 方法:用Real Time-PCR法和Western Blot法分別檢測肝臟和腎臟SCAP、SREBP-2及其下游基因LDLr mRNA和蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果:Real Time-PCR檢測表明,與對照組小鼠相比,炎癥組小鼠脂代謝相關(guān)基因LDLr、SREBP2和SCAP mRNA的表達分別增高了4