喉黏膜部位微生物分析及其與喉鱗癌關(guān)系的研究.pdf

1、喉癌是頭頸外科常見的惡性腫瘤，主要的病理類型為鱗狀細(xì)胞癌。主要危險因素包括吸煙，酗酒以及人乳頭狀瘤病毒感染等。近年研究報(bào)道幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，H.pylori）感染可能與喉癌相關(guān)，是喉癌的危險因素，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。H.pylori是作為獨(dú)立致病因子還是與其它菌群共同作用而致病尚不清楚。人類微生物組學(xué)(Human microbiome)認(rèn)為人體各解剖部位的菌群，作為一個有機(jī)群體通過許多復(fù)雜的機(jī)

2、制相互協(xié)調(diào)，共同作用，參與維持微環(huán)境的動態(tài)平衡。如果微環(huán)境菌群結(jié)構(gòu)失代償，菌群紊亂，則可能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。
　　本研究通過三個層面分析喉黏膜部位的微生物與喉鱗癌的關(guān)系:檢測H.pylori是否存在于喉黏膜，分析是否為喉鱗癌的危險因素;分析MSH2與MLH1基因在喉鱗癌中的表達(dá)水平，探討H.pylori是否誘導(dǎo)MSH2與MLH1表達(dá)改變而參與介導(dǎo)喉癌的發(fā)生;分析喉黏膜部位微生物的生態(tài)結(jié)構(gòu)及其與喉鱗癌的動態(tài)差異性。
　　第一部分

3、，H.pylori與喉鱗癌的相關(guān)性研究。
　　分析H.pylori是否定植于喉黏膜，是否與喉鱗癌存在相關(guān)性。采用病例對照研究，分析81例喉鱗癌患者和75例對照人群（聲帶息肉和會厭囊腫）的H.pylori感染情況。應(yīng)用巢式聚合酶鏈反應(yīng)(Nested polymerase chain reaction,nPCR)聯(lián)合DNA測序，檢測兩組人群喉部H.pylori感染情況。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme linked immunoso

4、rbent assay，ELISA)檢測血清H.pylori的IgG抗體。通過nPCR檢測，結(jié)果顯示H.pylori存在于喉黏膜，喉鱗癌人群陽性率(71.6％)顯著高于對照組人群(28.4％)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。腫瘤患者癌旁組織H.pylori陽性率高于腫瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)。應(yīng)用Logistic回歸模型排除混雜因素，結(jié)果表明H.pylori是喉癌的危險因素[OR=8.12，95％置信區(qū)間:(3.

5、07，21.53)，p＜0.001]。但通過ELISA檢測，結(jié)果顯示兩組人群的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(77.8％ vs.76.0％，p=0.79)。本部分研究通過nPCR發(fā)現(xiàn)H.pylori定植于喉黏膜，H.pylori感染與喉鱗癌存在相關(guān)性。推測該菌可能是喉癌的危險因素，喉黏膜可能是H.pylori的貯存部位和傳播的途徑之一。
　　第二部分，H.pylori誘導(dǎo)MSH2與MLH1基因表達(dá)改變在喉鱗癌中的機(jī)制研究。
　　分析MS

6、H2與MLH1在喉癌中的表達(dá)水平以及與生存函數(shù)的關(guān)系，探討定植于喉部的H.pylori是否誘導(dǎo)MSH2與MLH1的表達(dá)改變。收集兩組人群的組織樣本與病例資料。采用Real time PCR和Western blotting檢測第一組人群，21例喉鱗癌患者的MSH2與MLH1的mRNA與蛋白的表達(dá)水平。回顧性分析第二組人群180例喉鱗癌患者的的生存函數(shù)，同時采用組織芯片技術(shù)(Tissue microarray，TMA)聯(lián)合免疫組化分析MS

7、H2與MLH1表達(dá)水平。建立感染模型，研究H.pylori是否誘導(dǎo)MSH2與MLH1的表達(dá)改變。結(jié)果顯示第一組人群的MSH2與MLH1的表達(dá)水平在腫瘤組織低于癌旁正常組織(p＜0.001)。回顧性分析第二組喉癌患者的生存函數(shù)，結(jié)果表明MSH2與MLH1的表達(dá)水平與生存率相關(guān)，表達(dá)陰性患者生存時間低于陽性患者(MSH2:HR=4.38，95％置信區(qū)間:1.05-18.25; p=0.04;MLH1: HR=3.0，95％置信區(qū)間:1.76

8、-5.14;p＜0.001)。采用H.pylori標(biāo)準(zhǔn)菌株干擾喉癌細(xì)胞株HEp-2和AMC-HN-8，檢測在不同細(xì)菌干擾量及不同時間點(diǎn)的MSH2與MLH1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示H.pylori可以明顯降低MSH2與MLH1的表達(dá)水平(p＜0.05)。本部分研究揭示了喉鱗癌患者的腫瘤組織中MSH2與MLH1表達(dá)水平下調(diào)，表達(dá)陰性的喉鱗癌患者的生存時間降低。推測定植于喉部的H.pylori可能誘導(dǎo)MSH2與MLH1的表達(dá)降低而參與喉癌的發(fā)生。

9、
　　第三部分，喉黏膜微生物的生態(tài)結(jié)構(gòu)及其與喉鱗癌的動態(tài)差異性的研究。
　　分析喉黏膜部位微生物菌群整體的結(jié)構(gòu)特征，以及正常人群與喉鱗癌患者的菌群結(jié)構(gòu)的差異性。收集40例喉鱗癌患者與31例聲帶息肉的拭子樣本，同時收集對應(yīng)的組織樣本。采用454 Genome Sequencer FLX Titanium platform高通量測序，共檢測到14個門218個屬的菌群。正常人群中，喉部主要的菌群在門水平主要包括:Firmicute

10、s門(59.0％)，Proteobacteria門(10.8％)，Bacteroidetes門(10.4％),Fusobacteria門(10.1％),Actinobacteria門(10.0％)。喉鱗癌患者中，在門水平主要的菌群為:Firmicutes門(52.5％)，F(xiàn)usobacteria門(16.2％),Bacteroidetes門(16.5％),Proteobacteria門(11.0％),Actinobacteria門(5.

11、5％)。結(jié)果顯示會厭附近與喉部聲門上至聲門下的菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異性(p＜0.001)。喉鱗癌患者的菌群結(jié)構(gòu)和正常人群的分布存在明顯的差異性(p=0.006)，部分微生物可能與喉鱗癌存在相關(guān)性(p＜0.05)。本部分研究首次揭示了喉黏膜菌群的生態(tài)結(jié)構(gòu)，推測Peptostreptococcus屬，Prevotella屬， Parvimonas屬，Streptococcus屬，Granulicatella屬和螺桿菌屬等部分菌群是喉癌的危險因