喉鱗癌及癌前病變中PCDGF的作用研究.pdf

1、第一部分 喉鱗癌與癌前病變中PCDGF基因mRNA和蛋白質(zhì)表達及意義 目的畸胎瘤源性生長因子(PCDGF)是新近發(fā)現(xiàn)的生長因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用。至今，尚無研究關(guān)于鱗狀細胞癌，特別是喉癌的PCDGF表達狀態(tài)。本研究的目的是探討PCDGF與頭頸鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，從而衡量PCDGF的臨床價值。 方法檢測146例喉癌、108例成人乳頭狀瘤、41例喉粘膜白斑和10例正常喉部粘膜。利用實時定量PCR分析RNA表

2、達水平；用免疫組織化學分析蛋白表達和定位。 結(jié)果喉癌中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比正常粘膜的顯著增高(P＜0.001，P＜0.001)。同時喉部癌前病變(乳頭狀瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比正常粘膜的也明顯增高(P＜0.05，P＜0.05)。而喉部癌前病變(乳頭狀瘤、粘膜白斑)中PCDGF的RNA和蛋白質(zhì)水平比喉癌的明顯的低(P＜0.05，P＜0.05)。喉癌中PCDGF基因表達在各病理分級(χ2=3.84

3、；P＞0.05)和T分級(χ2=6.2，P＞0.05)之間差異無顯著性，而在是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(N0和N1)之間差異有顯著性意義(χ2=7.93；P＜0.05)。 結(jié)論PCDGF是喉癌癌變過程中重要的自分泌生長因子。我們的發(fā)現(xiàn)也提示PCDGF可能成為喉癌早期診斷、靶向治療和預后監(jiān)測的合理標志物。 第二部分 PCDGF發(fā)卡狀siRNA表達載體對Hep-2喉鱗癌細胞系PCDGF的表達和功能的影響 目的RNAi是

4、現(xiàn)代研究基因功能和發(fā)展治療的有力的工具。本研究探討siRNA誘導的PCDGF沉默成為喉癌的一種全新的輔助治療手段的可能性。 方法構(gòu)建含2條shRNA的RNAi質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染PCDGFshRNA至喉鱗癌細胞系Hep-2，針對轉(zhuǎn)染前后細胞通過繪制生長曲線測定生長增殖；軟瓊脂克隆形成實驗分析非錨著依賴性生長能力；裸鼠移植瘤實驗觀察致瘤性；利用流式細胞儀Annexin-Ⅴ-FITC和PI雙標記法檢測凋亡。 結(jié)果siRN

5、APCDGF轉(zhuǎn)染的克隆的PCDGF的水平比對照組的明顯低(73.7％)。siRNAPCDGF轉(zhuǎn)染組細胞數(shù)在無血清培養(yǎng)基中比對照組少75.3％(P＜0.001)。在含有10％FBS培養(yǎng)基中比對照組減少51.9％(P＜0.001)。并表現(xiàn)出受損的軟瓊脂克隆形成能力(p＜0.001)，致瘤性顯著減弱：40％成瘤率相對于對照組100％成瘤率；腫瘤重量要輕87％(0.46±0.6和2.2±0.5g；P＜0.01)。凋亡細胞比例從轉(zhuǎn)染前的21.40

6、％上升到71.72％(n=3；p＜0.001)。 結(jié)論PCDGF能正向調(diào)節(jié)喉癌細胞的增殖能力、非錨著依賴性克隆形成能力、裸鼠成瘤性和凋亡抵抗力。腫瘤要能發(fā)展，侵潤轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞必須能逃避因脫離其黏附的正常底物而引發(fā)的凋亡并能在新的基質(zhì)環(huán)境里保持高度的增殖活性。PCDGF很有可能參與喉癌致癌過程中這些獨立而相互促進的事件。我們的工作使siRNA誘導的PCDGF沉默可能成為喉癌的一種全新的潛在的輔助治療手段。 第三部分

7、 喉組織原代培養(yǎng)系統(tǒng)的建立 目的很多腫瘤研究是以建立的細胞系為基礎進行的。然而細胞系是在體外培養(yǎng)壓力下生長的一個克隆，并不代表整個細胞群體?，F(xiàn)已證實，原發(fā)腫瘤的短期培養(yǎng)對評估復雜的試驗結(jié)果更為可靠。建立一種有效便捷的喉癌培養(yǎng)體系，能同時收獲腫瘤上皮細胞和腫瘤相關(guān)成纖維細胞，能短時間收獲足夠多的活性高的細胞。更有利于腫瘤上皮與間質(zhì)的相互關(guān)系和化療藥物和放療的細胞特異性反應的研究。 方法本實驗在膠原酶法的基礎上作適當?shù)母牧?/p>

8、，克服微生物污染、細胞活性低生長緩慢、細胞不易純化、傳代困難。組織經(jīng)原代和傳代培養(yǎng)后，應用相差顯微鏡、HE染色、免疫組織化學和電鏡來觀察和鑒定原代分離培養(yǎng)的細胞。結(jié)果相差顯微鏡觀察細胞活性好。上皮細胞成鋪路石樣；成纖維細胞成梭狀密集。免疫組織化學染色顯示上皮細胞角蛋白陽性；成纖維細胞波形蛋白陽性。投射電鏡顯示上皮細胞為惡性腫瘤細胞特征。 結(jié)論本實驗采用的原代培養(yǎng)方法有效、便捷和經(jīng)濟?？梢垣@得活性好、純度高的細胞，為頭頸鱗癌的機制

9、研究提供了較為理想的細胞模型。 第四部分 喉組織成纖維細胞中PCDGF基因mRNA和蛋白質(zhì)表達及意義 目的PCDGF是腫瘤發(fā)生發(fā)展中新近發(fā)現(xiàn)的生長因子。最近，越來越多的資料證明，在腫瘤發(fā)生中，腫瘤相關(guān)的基質(zhì)并不僅僅是被動的反應者，更是主動的誘導者。至今，關(guān)于正常人類的成纖維細胞的PCDGF的表達尚無報道，且成纖維細胞分泌的PCDGF在致癌過程中的可能作用也不清楚。在此研究中，我們系統(tǒng)地檢測來源于喉癌、癌旁無癌組織

10、、正常喉組織和癌前病變(成人乳頭狀瘤)的成纖維細胞的PCDGF表達水平。 方法分別收集10例喉癌、相應癌旁、成人乳頭狀瘤和正常喉部粘膜標本。利用實時定量PCR和Western-blot法測細胞表達的PCDGF。通過第三部分建立的原代培養(yǎng)方法，我們還檢測了在體外持續(xù)培養(yǎng)的不同代數(shù)的成纖維細胞中的PCDGF的表達。結(jié)果在PCDGF的RNA表達和蛋白質(zhì)分泌水平方面，CAF比癌旁成纖維細胞(P＜0.01)、乳頭狀瘤成纖維細胞(P＜0.0

11、5)和正常喉成纖維細胞都明顯增高(P＜0.001)；乳頭狀瘤成纖維細胞比正常喉成纖維細胞也顯著增高(P＜0.05)；而癌旁成纖維細胞與正常喉成纖維細胞卻沒有顯著差異(P＞0.05)。CAF和乳頭狀瘤成纖維細胞的PCDGF表達水平都明顯增高。再者，第八代成纖維細胞的RNA和蛋白質(zhì)表達水平比第三代的明顯升高(p＜0.01，p＜0.01)。相反，在癌旁成纖維細胞與正常喉成纖維細胞，第八代成纖維細胞的RNA和蛋白質(zhì)表達水平與第三代的相比無顯著性