一個(gè)新的CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的初步研究.pdf

1、CD2分子是分布于胸腺細(xì)胞及所有成熟T淋巴細(xì)胞和大部分自然殺傷細(xì)胞表面的特征性分化抗原。CD2具有調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分化、成熟、激活和凋亡等功能，是介導(dǎo)T細(xì)胞抗原識(shí)別、粘附和介導(dǎo)淋巴細(xì)胞信號(hào)傳遞的重要細(xì)胞表面抗原。其富含脯氨酸的，帶正電荷的胞內(nèi)區(qū)具有信號(hào)傳遞和細(xì)胞粘附調(diào)節(jié)兩種功能，對(duì)于CD2的功能至關(guān)重要。尋找細(xì)胞內(nèi)可與CD2胞內(nèi)區(qū)相互作用的信號(hào)蛋白是CD2分子免疫學(xué)功能研究的熱點(diǎn)之一。本實(shí)驗(yàn)室通過酵母雙雜交系統(tǒng)，在人KT3T淋巴細(xì)胞cDN

2、A文庫中篩選到一個(gè)與CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的蛋白分子，經(jīng)與GeneBank數(shù)據(jù)庫比較分析此蛋白為人v-fos轉(zhuǎn)化效應(yīng)蛋白(Fte-1)，其與人核糖體小亞基蛋白S3a(RPS3a)為同一基因產(chǎn)物。Fte-1由264個(gè)氨基酸殘基組成，分子量為29.9KD。 Fte-1被認(rèn)為是一種典型的單基因多功能的蛋白，在多種腫瘤細(xì)胞和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中高水平表達(dá)。其除了作為核糖體小亞基的一個(gè)組成蛋白，參與翻譯起始之外，還具有復(fù)雜的核糖體外的功能，尤其在調(diào)節(jié)

3、細(xì)胞的存活，凋亡和轉(zhuǎn)化方面具有重要功能。其與CD2的相互作用尚屬首次發(fā)現(xiàn)。 本論文圍繞CD2胞內(nèi)區(qū)和Fte-1的相互作用進(jìn)行了以下研究： 1.應(yīng)用IAsyplusAffinitysensor生物大分子相互作用系統(tǒng)在體外研究CD2胞內(nèi)區(qū)和Fte-1的相互作用。證明其確實(shí)為特異性的相互結(jié)合作用。KD值為2×10-7， 2.將Fte-1蛋白序列提交PROSITE數(shù)據(jù)庫分析，證明其并不包含與蛋白質(zhì)相互作用相關(guān)的特殊結(jié)構(gòu)域

4、。但其含有三個(gè)可能的PKC磷酸化位點(diǎn)。 3.體外磷酸化實(shí)驗(yàn)證明Fte-1蛋白可被PKC磷酸化。進(jìn)一步構(gòu)建包含不同可能PKC磷酸化位點(diǎn)的缺失片段的表達(dá)載體，獲得各缺失突變的多肽后，進(jìn)行體外磷酸化實(shí)驗(yàn)。證明，F(xiàn)te-1蛋白只有其C-端的可被磷酸化。將Ser238突變?yōu)镚ly后，此位點(diǎn)不再被磷酸化。 4.通過體內(nèi)磷酸化實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Fte-1蛋白可被內(nèi)源性的PKC磷酸化。 5.同時(shí)考察缺失片段與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用，

5、發(fā)現(xiàn)當(dāng)Fte-1蛋白C-端237位之后包含PKC作用位點(diǎn)的片段缺失后，與CD2胞內(nèi)區(qū)不再結(jié)合。而N-端缺失對(duì)其與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用沒有影響。這證明Fte-1的C-末端對(duì)其與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合作用非常重要，這可能與PKC的磷酸化作用相關(guān)。 6.利用Pulldown方法確證Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)的相互作用。 7.利用激光共聚焦技術(shù)觀察到，F(xiàn)te-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位為簇集性的分布，可能與其參與核糖體組成有關(guān)。其N-端對(duì)

6、其在細(xì)胞內(nèi)的定位很重要，C-端的部分缺失不影響其在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后的定位。 8.在抗CD2單克隆抗體T11刺激Jurkat細(xì)胞后，F(xiàn)te-1的定位發(fā)生明顯變化，與CD2共定位于細(xì)胞膜上。提示在細(xì)胞內(nèi)Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)的結(jié)合有賴于CD2介導(dǎo)的細(xì)胞激活信號(hào)。 9.Fte-1蛋白PKC磷酸化位點(diǎn)的突變使Fte-1失去與CD2分子共定位的能力，說明Fte-1的PKC磷酸化對(duì)Fte-1和CD2在T淋巴細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合至關(guān)重要。

7、 單獨(dú)用PMA刺激細(xì)胞，僅使Fte-1失去簇集分布的特征，但并不使其與CD2共定位。推測PKC磷酸化可能是Fte-1與CD2胞內(nèi)區(qū)結(jié)合的下游事件，參與了CD2介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。 10.使用反義序列或siRNA抑制Fte-1在Jurkat細(xì)胞中的表達(dá)，可以抑制Jurkat細(xì)胞激活后的細(xì)胞凋亡。提示Fte-1可能參與對(duì)T細(xì)胞激活和死亡的調(diào)節(jié)，其機(jī)理可能與Fte-1與CD2的相互作用有關(guān)。 本研究證明，F(xiàn)te-1與CD2在T細(xì)