當(dāng)歸多糖對2型糖尿病預(yù)防及治療作用的初步研究.pdf

1、糖尿病(DiabetesMellitus,DM)是一種由胰島素抵抗引起的代謝紊亂的內(nèi)分泌疾病。其中2型糖尿病占90％以上。隨著人們生活水平的不斷提高,糖尿病的發(fā)病率也來越高,對人們的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響。近年來由于新藥資源的尋找與開發(fā),中藥多糖的研究越來越受到重視。據(jù)報道約有800種藥用植物有降糖作用。當(dāng)歸多糖是中藥當(dāng)歸的主要生物活性成分,在抗貧血、抗肝損傷和抗腫瘤等方面具有顯著活性,但關(guān)于當(dāng)歸多糖降糖作用及其機(jī)制的研究甚少。本實驗以岷

2、縣當(dāng)歸飲片為原料,提取純化后得到性狀穩(wěn)定的當(dāng)歸多糖,在此基礎(chǔ)上分別研究當(dāng)歸多糖對2型糖尿病初步的預(yù)防及治療作用,探究當(dāng)歸多糖新的藥理活性。
　　第一部分當(dāng)歸多糖的提取與純化
　　本實驗采用岷縣當(dāng)歸飲片為原料,經(jīng)水提醇沉法得到當(dāng)歸粗多糖。多糖溶液經(jīng)反復(fù)凍融去除溶液中不穩(wěn)定成分,透析去除小分子雜質(zhì)、單糖和寡糖等水溶性成分,微濾后得到澄清透明的當(dāng)歸多糖溶液,最后經(jīng)凍干后得到性狀穩(wěn)定的當(dāng)歸多糖。通過測定當(dāng)歸多糖的糖含量、相對分子質(zhì)量

3、以及紫外掃描進(jìn)行其純度鑒定。經(jīng)過此法制得的當(dāng)歸多糖,經(jīng)苯酚-硫酸法測得糖含量穩(wěn)定保持在65%左右。高效凝膠色譜法測得其重均分子質(zhì)量為9.512×104Da。紫外掃描結(jié)果顯示當(dāng)歸多糖不含蛋白質(zhì)和核酸。結(jié)果表明此法能制得比較純凈且性狀穩(wěn)定的當(dāng)歸多糖。
　　第二部分當(dāng)歸多糖對HFD誘導(dǎo)的小鼠前趨糖尿病的預(yù)防作用研究
　　實驗采用高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)建立胰島素抵抗的前趨糖尿病小鼠模型。實驗小鼠隨機(jī)分為四組,每組12只?？瞻讓φ战M(

4、NC)給予普通飼料自由喂養(yǎng);當(dāng)歸多糖低劑量組(LASP)每天給予400mg/kg當(dāng)歸多糖灌胃,HFD自由喂養(yǎng);當(dāng)歸多糖高劑量組(HASP)每天給予600mg/kg當(dāng)歸多糖灌胃,HFD自由喂養(yǎng);陰性對照組(PC)每天灌胃等量的生理鹽水,HFD自由喂養(yǎng)。每十天記錄一次各組小鼠的體重、空腹血糖(FPG)、血脂變化。四周后測定的血樣指標(biāo)中陰性對照組出現(xiàn)明顯的高血糖、高胰島素和高血脂等胰島素抵抗綜合征,當(dāng)歸多糖干預(yù)組的各項指標(biāo)均有所降低。LASP

5、組和HASP組均能顯著性降低小鼠的FPG(PC組:7.08mmol/L;LASP組:6.20mmol/L*;HASP:6.87mmol/L*),顯著性降低空腹胰島素FIns(PC組:44.40μIU/mL;LASP組:22.33μIU/mL**;HASP:32.35μIU/mL**),顯著性降低胰島素抵抗指數(shù)INRI(PC組:8.76;LASP組:4.22**;HASP:4.69**),對總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)無明顯影響。小

6、鼠解剖后迅速切取部分肝臟、胰腺和附睪脂肪,濾紙吸干表面水分后浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)洗滌后進(jìn)行包埋、切片和HE染色。觀察小鼠HE染色的切片發(fā)現(xiàn),PC組小鼠的肝臟、胰島出現(xiàn)明顯的脂肪空洞和變性,脂肪細(xì)胞體積變大等胰島素抵抗的病理形態(tài)學(xué)特征,LASP組和HASP組均能保護(hù)肝臟、胰島和脂肪組織,緩解HFD導(dǎo)致的胰島素抵抗。結(jié)果表明當(dāng)歸多糖對前趨糖尿病有良好的預(yù)防作用。
　　第三部當(dāng)歸多糖對小鼠2型糖尿病的治療作用研究

7、　　實驗采用HFD喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ單次腹腔注射的方法,誘導(dǎo)建立T2DM小鼠模型。隨機(jī)挑選10只小鼠作為空白對照組(NC),全程普通飼料喂養(yǎng);其余70只小鼠高脂高糖飼料(HFD)喂養(yǎng)四周后,按照80mg/kg的劑量STZ單次腹腔注射,三天后檢測空腹血糖(FPG)有無變化,兩周后FPG居高不下并且大于等于11.1mmol/L即為T2DM(type2diabetemellitus)模型組小鼠。模型組小鼠隨機(jī)分為5組,每組12只,均普通飼料

8、喂養(yǎng)。當(dāng)歸多糖低劑量組(LASP)、中劑量組(MASP)和高劑量組(HASP)每天分別按照100mg/kg、200mg/kg、400mg/kg劑量灌胃當(dāng)歸多糖,陽性對照組(PC)按照200mg/kg的劑量灌胃二甲雙胍,陰性對照組(DC)給予等量的生理鹽水。四周后當(dāng)歸多糖各劑量組均能一定程度上降低小鼠的PFG(DC組:26.3mmol/L;LASP組:22.3mmol/L;MASP組:24.0mmol/L;HASP:25.4mmol/L)

9、,增加FIns水平(DC組:3.7μIU/mL;LASP組:4.5μIU/mL;MASP組:4.9μIU/mL;HASP:5.0μIU/mL)。小鼠解剖后迅速稱量完整的肝臟,計算肝臟指數(shù);切取部分肝臟和胰腺組織,濾紙吸干表面水分后浸泡于10%多聚甲醛溶液中固定,常規(guī)洗滌后進(jìn)行包埋、切片和HE染色處理;迅速取各組小鼠的肝臟和骨骼肌組織,生理鹽水漂洗后濾紙吸干,分裝于凍存管中-80℃凍存。通過計算肝臟指數(shù)發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸多糖對前趨糖尿病小鼠的肝臟指

10、數(shù)無明顯影響。糖原測定結(jié)果表明當(dāng)歸多糖各劑量組均能一定程度上增加肌糖原(MG)含量(DC組:1.01mg/g;LASP組:1.06mg/g;MASP組:1.21mg/g*;HASP:1.17mg/g*);增加肝糖原(HG)含量(DC組:6.68mg/g;LASP組:7.09mg/g;MASP組:8.51mg/g*;HASP:7.55mg/g*)。觀察各組小鼠HE染色切片發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸多糖各劑量組均能一定程度上緩解肝臟和胰腺的胰島素抵抗。通過

11、探討當(dāng)歸多糖緩解胰島素抵抗的機(jī)制研究表明,當(dāng)歸多糖能顯著性降低炎癥因子IL-6水平(DC組:54.12pg/mL;LASP組:41.59pg/mL**;MASP組:44.48**pg/mL),顯著性降低TNF-α水平(DC組:320.09pg/mL;LASP組:242.40pg/mL**;MASP組:255.52pg/mL**;HASP組:298.83pg/mL)。結(jié)果表明當(dāng)歸多糖可能通過降低炎癥因子TNF-α和IL-6的含量來緩解胰島