熒光定量PCR測(cè)定鼻咽癌患者血清中游離的EBV-DNA.pdf

1、目的：建立FQ-PCR(real-time Fluorescent Quantitative PCR)系統(tǒng)，定量檢測(cè)鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)患者血清中游離的EBV(EpsteinBarr Virus，EBV)-DNA，探索EBV-DNA用于NPC的診斷、預(yù)后判斷及療效判斷的價(jià)值。 方法：收集101例鼻咽癌患者和49例正常對(duì)照者血清作為檢測(cè)標(biāo)本。101例患者中Ⅰ期3例，Ⅱ期11例，Ⅲ期39

2、例，Ⅳ期48例。根據(jù)鼻咽癌患者血清中游離的EBV-DNA基因全序列設(shè)計(jì)引物和探針，PCR擴(kuò)增EBV-DNABamHI-W基因片段，并將其克隆到pGEM-T Easy載體上，構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品；建立FQ-PCR體系。用已建立的熒光定量PCR方法對(duì)EBV-DNA含量進(jìn)行定量檢測(cè)所有標(biāo)本。同時(shí)采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清EBV衣殼抗原的IgA抗體(IgA/VCA)。 結(jié)果： 1、NPC患者治療前血清EBV-DNA平均濃度為58400

3、 copies/ml和陽(yáng)性檢出率為90.6％(91/101)，患者治療后血清EBV-DNA平均濃度為(1243.36copies/ml，18.75％8/44)和正常人血清EBV-DNA水平平均濃度為0copies/ml和檢出率分別為0％(0/49)。NPC患者治療前血清EBV-DNA水平顯著高于治療后和正常人(P均<0.01)。NPC患者治療前血清EBV-DNA陽(yáng)性檢出率顯著高于治療后和正常人(P均小于0.05)。NPC患者治療后血清E

4、BV-DNA水平和檢出率與正常人比較，差異均無(wú)顯著意義(Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P=0.256；卡方檢驗(yàn)，P=0.223)。血清VCA/IgA抗體陽(yáng)性率為83.1％(84/101)明顯高于正常對(duì)照組(4.1％，2/49)。鼻咽癌患者EBV-DNA水平陽(yáng)性率90.6％，同時(shí)血清VCA-IgA的陽(yáng)性率為83.1％，DNA檢測(cè)靈敏度略高于VCA/IgA檢測(cè)。 2、Ⅲ-Ⅳ期鼻咽癌患者的血清EBV-DNA陽(yáng)性率(89.7％，35

5、/39；89.6％，43/48)較Ⅰ-Ⅱ(72.7％8/11)期患者為高，有顯著性差異(P<0.01)。NPC患者治療前血清EBV-DNA水平隨臨床TNM分期越晚而顯著增高。Ⅰ期為3390±1540copies/ml，Ⅱ期為11802±5603copies/ml，III期為56488±27234 copies/ml，IV期為722275±321351copies/ml，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示各臨床分期間的鼻咽癌

6、患者血清中游離EBV-DNA的平均拷貝數(shù)均有顯著性差異(P<0.005)。 3、鼻咽癌患者治療前血清VCA/IgA S/CO平均值為3.8158(S/CO>1為陽(yáng)性，<1為陰性)，略高于治療后平均值3.1261(P>0.05)差別無(wú)顯著意義。但明顯高于正常對(duì)照組0.7318(P<0.05)，差別有顯著意義。NPC患者治療前血清EBV-DNA水平平均值為58400拷貝/ml顯著高于治療后(平均值為1243.36拷貝/ml)(P<0

7、.05)和正常人(中位值0拷貝/ml)(P<0.01)。 結(jié)論： 1.成功建立了鼻咽癌患者血清中EB病毒DNA的FQ-PCR定量檢測(cè)體系。該體系檢測(cè)FQ-PCR定量檢測(cè)體系結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性和特異性好。 2.血清EB病毒游離DNA可用于監(jiān)測(cè)鼻咽癌患者的治療效果，其價(jià)值明顯優(yōu)于VCA/IgA。 3.熒光定量PCR法檢測(cè)血清EB病毒游離DNA可作為鼻咽癌的診斷、臨床分期、腫瘤負(fù)荷的方法之一。

8、 5603copies/ml，III期為56488±27234 copies/ml，IV期為722275±321351copies/ml，Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示各臨床分期間的鼻咽癌患者血清中游離EBV-DNA的平均拷貝數(shù)均有顯著性差異(P＜0.005)。3、鼻咽癌患者治療前血清VCA/IgA S/CO平均值為3.8158(S/CO＞1為陽(yáng)性，＜1為陰性)，略高于治療后平均值3.1261(P＞0.05)差別無(wú)

9、顯著意義。但明顯高于正常對(duì)照組0.7318(P＜0.05)，差別有顯著意義。NPC患者治療前血清EBV-DNA水平平均值為58400拷貝/ml顯著高于治療后(平均值為1243.36拷貝/ml)(P＜0.05)和正常人(中位值0拷貝/ml)(P＜0.01)。 結(jié)論： 1.成功建立了鼻咽癌患者血清中EB病毒DNA的FQ-PCR定量檢測(cè)體系。該體系檢測(cè)FQ-PCR定量檢測(cè)體系結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性和特異性好。