納米銀生理毒物動力學模型(PBTK)構建與驗證.pdf

1、目的:
　　納米科技飛速發(fā)展，形成了眾多分支，如納米毒理學、納米生物學、納米藥物學和納米電子學等，由于具有與常規(guī)材料不同的光學、電學、熱學、力學或化學性能，納米材料被應用于各個領域。納米銀是目前商品化程度最高的納米材料之一，因其具有獨特的廣譜抗菌性能，在衛(wèi)生、保健、醫(yī)學等領域廣泛使用。然而納米顆粒尺寸微小，易于通過血腦屏障、血睪屏障和血眼屏障等各種生物屏障并與體內大分子發(fā)生相互作用，對人體可能具有潛在的危害，納米材料的安全性也備受

2、關注。
　　目前針對納米銀的毒理學研究主要集中于細胞培養(yǎng)體系等體外實驗，并不能準確反映納米銀進入生物體的變化過程和對生物體的毒性作用。而已有的實驗中，對于通過各種途徑進入生物體的納米銀在體內的生物動力學及生物學效應研究尚不充分，因此有必要進一步開展納米銀的體內生物效應研究以及相關的體內生物動力學研究，這對于納米銀的安全性評價及納米產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要意義[4]。
　　生理毒代動力學（Physiologically b

3、ased toxicokinetics，PBTK）模型以生理學和解剖學為基礎，通過血流將各個臟器和組織有機地聯(lián)系起來，反映毒物隨血流進入各個臟器和組織，進行轉化、代謝和排泄的過程。根據(jù)質量守恒定律，通過微分方程，將毒物在各個臟器和組織的動態(tài)變化描述出來，對方程組求解，便可以了解毒物隨著時間在各個臟器和組織的靶劑量。PBTK模型是一種新型劑量預測方法，能夠有效地預測生物體毒物內暴露劑量，有助于定量地評估外暴露毒物劑量（外劑量）和內暴露毒物

4、劑量（內劑量）以及毒效應之間的關系，是風險評估中的新技術。
　　本研究使用兩種不同粒徑的納米銀材料AgNPs-20(20nm納米銀，PVP包被，標示銀含量25％)和AgNPs-100（100nm納米銀，標示銀含量99.5％），大鼠單次尾靜脈染毒，染毒濃度分別為120 mg/kg和30 mg/kg(以銀含量計，均為30mg/kg)。并設置陰性對照組PVP，染毒濃度為90 mg/kg。同時設置硝酸銀AgNO3作為納米銀在體內可能釋放銀

5、離子的對照，染毒濃度為5 mg/kg(以銀含量計，為3.2 mg/kg)。研究大鼠染毒后急性毒性作用、血液動力學、組織分布、排泄情況。并在此基礎之上，通過查閱相關文獻，利用Acsl軟件初步建立PBTK模型，通過實驗所得的納米銀體內數(shù)據(jù)驗證與優(yōu)化模型。為研究納米銀材料的健康效應及安全性評價提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.納米銀材料表征:①使用TEM和SEM觀測形態(tài)特征，粒徑大小;②使用馬爾文粒度儀測定納米銀在生理鹽水中的水合粒

6、徑。③使用ICP-MS檢測納米銀材料實際銀含量。
　　2.納米銀對大鼠的急性毒性研究:大鼠單次尾靜脈染毒，于染毒后1d，7d，14d處死，取血清、臟器、尿液標本。①觀測一般性指標和臟器系數(shù)的變化;②血清和尿生化學指標檢測，包括:肝功能指標(TP，ALB，ALT，AST，ALP)、心功能指標(CK，CK-MB)、腎功能指標(BUN，UP，UA，Cre);③觀察組織病理改變。
　　3.納米銀在大鼠體內的血液動力學和生物分布研究:

7、①血液動力學研究:大鼠麻醉后行股靜脈插管手術，尾靜脈染毒后，通過股靜脈經(jīng)時(5 min，10 min，20 min，30 min，1h，2h，4h，6h)取血，ICP-MS檢測血中銀含量，應用DAS藥物動力學軟件計算相關動力學參數(shù)，進行血液動力學研究。②組織分布研究:大鼠單次尾靜脈染毒，于染毒后1d，7d，14d處死，ICP-MS檢測腦、心、肺、肝、脾和腎各組織臟器中的銀含量，進行納米銀體內分布研究;③排泄途徑研究:大鼠染毒后于不同時間

8、收集尿液和糞便，ICP-MS檢測糞便和尿液中銀含量，進行納米銀排泄研究。
　　4.納米銀PBTK模型構建與驗證:①查閱文獻收集大鼠的生理參數(shù)以及納米銀相關的生化參數(shù)，確立模型的結構和微分方程組，應用Acsl軟件編寫程序，構建PBTK模型。②利用已有的大鼠體內納米銀染毒數(shù)據(jù)，驗證與優(yōu)化PBTK模型。
　　結果:
　　1.納米銀材料表征:AgNPs-20呈球形，分散良好，平均粒徑21.54 nm，平均水合粒徑為43.76

9、nm，含銀量29.08％。AgNPs-100呈橢球形，平均粒徑79.04nm，平均水合粒徑為952.10 nm，含銀量99.84％。
　　2.納米銀對大鼠的急性毒性研究:①一般性指標和臟器系數(shù)的影響:與PVP對照組相比，AgNPs-20、AgNPs-100和AgNO3染毒后的大鼠毛色輕微灰暗，攝食和飲水減少，染毒3天左右恢復。染毒1d后，與PVP對照組相比，AgNO3染毒組的肝臟臟器系數(shù)增大，AgNPs-20染毒組和AgNPs-1

10、00染毒組肝臟臟器系數(shù)降低(P＜0.05)。②血清及尿液生化指標的影響:染毒1d時，與PVP對照組相比，AgNO3染毒組的TP含量下降，AgNPs-20染毒組的AST含量上升，AgNPs-100染毒組的ALT和AST含量上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01，P＜0.05)。染毒7d時，與PVP對照組相比，AgNPs-20染毒組和AgNPs-100染毒組的AST含量上升，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)，其他指標和PVP對照組相比無顯

11、著差異。③組織病理學檢查:染毒7d后，與PVP對照組相比AgNPs-20染毒組和AgNPs-100染毒組大鼠肝臟有輕微病變，染毒1d、14d后，各組織病理學檢查無異常。
　　3.納米銀在大鼠體內的血液動力學和生物分布研究:①血液動力學:兩組納米銀染毒組血銀水平在1h內均呈快速下降趨勢，1h～6h維持穩(wěn)定。AgNO3染毒組大鼠的血銀水平下降速度很快，在10 min時趨于穩(wěn)定。采用DAS藥物動力學軟件計算，經(jīng)統(tǒng)計矩分析，AgNPs-2

12、0、AgNPs-100和AgNO3組的主要動力學參數(shù)為:血液銀含量-時間曲線下面積(AUC，mg/L*h)分別為:57.41±28.21，106.99±11.60，55.88±9.26;平均滯留時間(MRT，h)分別為0.54±0.27，1.88±0.11，2.57±0.11;消除半衰期(t1/2，h)分別為0.80±0.30，1.88±0.23，6.06±4.67;清除率（CL，L/h*kg）分別為0.63±0.35，0.25±0.0

13、3，0.04±0.02;分布容積（Vd，L/kg）分別為0.79±0.70，0.68±0.07，0.23±0.04。②組織分布:尾靜脈注射納米銀后，在腦、心、肺、肝、脾和腎各主要臟器中均可檢測到不同水平的銀。染毒1d時，AgNPs-20主要分布在肝臟和脾臟，AgNPs-100主要分布在肺臟，AgNO3主要分布在肝臟;染毒14d時，兩納米銀組的主要分布組織均為肝臟和脾臟。AgNO3主要分布于肝臟、脾臟和腎臟。③排泄途徑:糞便和尿液14d累

14、積排泄率分別為:AgNPs-20(6.97％，0.15％)，AgNPs-100(4.40％，0.11％)，AgNO3(22.06％，7.60％)。糞便為納米銀主要排泄途徑。
　　4.PBTK模型構建與驗證結果:①通過收集大鼠生理學參數(shù)，納米銀生化指標，編譯微分方程，初步構建AgNPs-20和AgNPs-100在大鼠體內的PBTK模型。②使用回歸分析方法比較動物實驗肝臟、血液數(shù)據(jù)與模型擬合數(shù)據(jù)，表明該模型對實際數(shù)據(jù)擬合較好，血液擬合

15、數(shù)據(jù)Pearson相關系數(shù)分別為0.774和0.754。
　　結論:
　　大鼠尾靜脈染毒30 mg/kg AgNPs-20和AgNPs-100后，體重、臟器系數(shù)和血清生化學和組織病理學改變提示大鼠的肝臟出現(xiàn)了輕微的急性毒性效應。體內動力學和生物分布研究結果表明納米銀在大鼠體內各主要臟器均有分布，特別是在腦組織中也有檢出，說明納米銀或銀離子可穿透血腦屏障進入腦組織。不同粒徑納米銀在體內分布模式有所不同，染毒1d后，AgNPs-

16、20主要分布在肝臟和脾臟中，AgNPs-100在肺臟濃度最高、肝臟和脾臟次之。染毒14d后，主要分布器官均為肝臟和脾臟，AgNPs-20組肝脾銀濃度為AgNPs-100組的6～7倍，認為肝臟和脾臟為納米銀蓄積和作用靶器官，小尺寸納米銀在靶器官中蓄積更嚴重。排泄途徑研究表明，納米銀進入大鼠體內后主要經(jīng)糞便排泄，14d內經(jīng)尿液排泄量僅為糞便排泄量的2％～2.5％，AgNPs-20的排泄速率比AgNPs-100略快，銀離子進入大鼠體內也主要經(jīng)