FoxM1在人結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用及其對(duì)COX-2相關(guān)通路的影響.pdf

1、結(jié)直腸癌（colorectal carcinoma，CRC）目前仍是全世界范圍內(nèi)危害人類健康的重大疾病之一。
　　叉頭框蛋白M1（fork head box M1，F(xiàn)oxM1）隸屬于叉頭框（fork head box，F(xiàn)ox）轉(zhuǎn)錄因子家族，其在腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移等相關(guān)事件中發(fā)揮重要作用。FoxM1信號(hào)通路在細(xì)胞發(fā)育過程包括維護(hù)細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡起到了重要作用，其異常改變可導(dǎo)致細(xì)胞癌變。FoxM1在多種惡性腫瘤組織中異常高

2、表達(dá)，并與多種癌基因信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)。特異性FoxM1抑制劑在腫瘤治療方面的研究提示FoxM1極有希望成為一個(gè)新的抗癌靶點(diǎn)。
　　本研究首先篩選出不同F(xiàn)oxM1表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞株，應(yīng)用RNAi技術(shù)及FoxM1過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染結(jié)腸癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在FoxM1高表達(dá)株HT29中下調(diào)FoxM1可抑制細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移；而在低表達(dá)株HCT116細(xì)胞中上調(diào)FoxM1則結(jié)果相反。進(jìn)一步，我們構(gòu)建了慢病毒感染結(jié)腸癌細(xì)胞株的穩(wěn)定表達(dá)株，并建

3、立移植瘤動(dòng)物模型，及觀測(cè)腫瘤生長(zhǎng)，結(jié)果同樣表明，F(xiàn)oxM1高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤增殖，F(xiàn)oxM1低表達(dá)則對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移有抑制作用。
　　我們通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR及Westen blot方法，在HCT-116及HT29細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，COX-2表達(dá)水平與FoxM1正相關(guān)，上調(diào)FoxM1表達(dá)可觀察到COX-2基因表達(dá)增強(qiáng)，而抑制FoxM1表達(dá)則可觀察到相反結(jié)果。進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)分析FoxM1和COX-2在CRC組織中

4、的表達(dá)，結(jié)果顯示，F(xiàn)oxM1和COX-2在結(jié)腸癌組織中表達(dá)水平明顯高于正常結(jié)腸組織，并與結(jié)腸癌的TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移均相關(guān)。這提示，F(xiàn)oxM1及COX-2均參與CRC的發(fā)生及發(fā)展，并在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用。因此，本研究提示：FoxM1可能通過調(diào)控COX-2表達(dá)從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oxM1基因有望成為逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。
　　這提示，F(xiàn)oxM1及COX-2均參與CRC的發(fā)生及發(fā)展，并

5、在腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用。因此，本研究提示：FoxM1可能通過調(diào)控COX-2表達(dá)從而參與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移，F(xiàn)oxM1基因有望成為逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點(diǎn)。
　　本文主要從以下幾方面進(jìn)行了論述:
　　第一部分 FOXM1在結(jié)腸癌中的表達(dá)及功能分析
　　目的：探討FoxM1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。
　　方法：通過Real-timePCR、Western blot方法，檢測(cè)人結(jié)

6、腸癌細(xì)胞株KM12SM、HT29和HCT116以及正常結(jié)腸細(xì)胞上皮細(xì)胞株HcoEpiC中FoxM1基因的表達(dá)水平差異，分別篩選出高表達(dá)株及低表達(dá)株。設(shè)計(jì)3條針對(duì)FoxM1的siRNA序列，篩選出RNA干涉效果最佳的siRNA，合成RNA干涉載體（pGPH-shFoxM1），同時(shí)合成FoxM1基因過表達(dá)載體（pEX-2-eGFP-FoxM1）。應(yīng)用RNA干涉技術(shù)高效抑制FoxM1在HT29細(xì)胞中的表達(dá)，并采用過表達(dá)質(zhì)粒上調(diào)HCT-116中

7、FoxM1的表達(dá)水平，然后分別采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室法檢測(cè)上述轉(zhuǎn)染細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲能力的變化。進(jìn)一步應(yīng)用慢病毒載體構(gòu)建過表達(dá)載體pGLV4-FoxM1及RNA干涉載體pGLV3-shFoxM1，同時(shí)設(shè)立相應(yīng)的慢病毒載體陰性對(duì)照，將其分別轉(zhuǎn)染HCT116及HT29細(xì)胞，從而篩選出穩(wěn)定表達(dá)株。最后建立上述穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的裸鼠皮下移植瘤模型，定時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤生長(zhǎng)大小，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。
　　結(jié)果：應(yīng)用陰性對(duì)照NC-FAM-

8、Si轉(zhuǎn)染HT-29細(xì)胞，根據(jù)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率差異，優(yōu)化siRNA轉(zhuǎn)染條件在24孔板中，每孔LipofectamineTM20001μL、siRNA濃度60pmol、共轉(zhuǎn)染48h。根據(jù)設(shè)計(jì)的3條FoxM1 siRNA序列，最終選定FoxM1 siRNA為：5’-GGCUGCACUAUCAACAAUATT-3’，繼而根據(jù)該序列合成pGPH-shFoxM1。分別應(yīng)用對(duì)照質(zhì)粒pGPH-shNC及pEX-2-NC在HT29及HCT-116細(xì)胞

9、中再次優(yōu)化RNA干涉質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件。根據(jù)轉(zhuǎn)染效率及細(xì)胞存活率差異，確定最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染條件為：脂質(zhì)體為2.5μL/孔，pGPH-shNC或pEX-2-NC濃度1.5μg/孔（24孔板），共培養(yǎng)48h。熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR及Westen blot結(jié)果提示，F(xiàn)oxM1在HT29細(xì)胞中高表達(dá)，而在HCT116細(xì)胞中呈低表達(dá)。應(yīng)用PEX-2-FoxM1上調(diào)HCT-116細(xì)胞中FoxM1表達(dá)后，細(xì)胞的劃痕愈合能力在HCT-116實(shí)驗(yàn)組中[（70.9

10、2±1.48）％]與HCT-116實(shí)驗(yàn)對(duì)照組[（16.92±4.05）%]及HCT-116空白對(duì)照組[（16.66±2.63）%]相比顯著增強(qiáng)（P<0.05），Transwell小室穿膜細(xì)胞數(shù)在HCT-116實(shí)驗(yàn)組中（186±6.8）與HCT-116實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（42±2.0）及HCT-116空白對(duì)照組（37±2.2）相比增加（P<0.05）。反之，應(yīng)用pGPH-shFoxM1下調(diào)HT-29細(xì)胞中FoxM1表達(dá)后，細(xì)胞的劃痕愈合能力在HT

11、-29實(shí)驗(yàn)組中[（10.37±3.86）%]與HT-29實(shí)驗(yàn)對(duì)照組[（34.63±2.35）%]及HT-29空白對(duì)照組[（67.36±2.61）%]相比顯著下降（P<0.05），Transwell小室穿膜細(xì)胞數(shù)在HT-29實(shí)驗(yàn)組中（53±1.8）與HT-29實(shí)驗(yàn)對(duì)照組（95±2.2）及HT-29空白對(duì)照組（118±4.0）相比也減少（P<0.05）。
　　在裸鼠移植瘤模型中，當(dāng)上調(diào)FoxM1表達(dá)水平后，HCT116細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能

12、力顯著增強(qiáng)；反之，下調(diào)FoxM1表達(dá)水平后，HT29細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力明顯下降，提示細(xì)胞增殖能力受阻。
　　結(jié)論：FoxM1表達(dá)與CRC的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；靶向FoxM1的特異性siRNA可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，而上調(diào)CRC細(xì)胞株中FoxM1表達(dá)則可促進(jìn)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本部分研究提示FoxM1可能成為抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移新的分子靶點(diǎn)。
　　第二部分 FoxM1在結(jié)腸癌細(xì)胞株中對(duì)COX-2等基因表

13、達(dá)的影響
　　目的：通過了解FoxM1在結(jié)腸癌細(xì)胞中對(duì)COX-2等基因的表達(dá)調(diào)控，探討FoxM1參與調(diào)節(jié)人結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制。
　　方法：應(yīng)用Real-timePCR及Westen blot，在未處理水平檢測(cè)COX-2在結(jié)腸癌細(xì)胞中的表達(dá)水。進(jìn)一步將FoxM1基因RNA干涉載體（pGPH-shFoxM1）、過表達(dá)載體（FoxM1-eGFP）及其空質(zhì)粒（NC-eGFP）分別轉(zhuǎn)染人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116和HT29

14、，并檢測(cè)COX-2表達(dá)水平變化，并進(jìn)一步檢測(cè)與細(xì)胞增殖，侵襲、轉(zhuǎn)移、DNA修復(fù)等相關(guān)的基因表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果：Real-timeRT-PCR及Westen blot結(jié)果均證實(shí)，無論在mRNA水平還是在蛋白表達(dá)水平，HT29細(xì)胞株中COX-2表達(dá)均高于HCT-116細(xì)胞株，這與FoxM1在兩株細(xì)胞株中表達(dá)水平相一致（詳見第一部分）。在HCT-116細(xì)胞株中，過表達(dá)FoxM1后，COX-2 mRNA及蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，而當(dāng)

15、采用pGPH-shFoxM1轉(zhuǎn)染抑制FoxM1表達(dá)后，COX-2表達(dá)水平顯著下降。在HT29細(xì)胞中，可觀察到一致的結(jié)果。此外，在HCT-116和HT29中，當(dāng)過表達(dá)FoxM1后，p-Akt、MMP-2、MMP-7、MMP-9、NFκB-P65、NFκB-P50等蛋白表達(dá)顯著上升，而抑制FoxM1表達(dá)，上述蛋白表達(dá)水平則下降。
　　結(jié)論：FoxM1可調(diào)控CRC細(xì)胞株中腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，其中COX-2表達(dá)水平變化與Fo

16、xM1呈正相關(guān)。因此，F(xiàn)oxM1和COX-2及其相關(guān)的信號(hào)通路均可能參與了結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　第三部分 FoxM1與COX-2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性分析
　　目的：探討FoxM1和COX-2在CRC組織中的表達(dá)及兩者的相關(guān)性。
　　方法：采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)95例CRC組織和40例正常結(jié)腸組織中FoxM1和COX-2的表達(dá)，并分析FoxM1和COX-2分別與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)間的關(guān)系，以及探討兩者表達(dá)

17、之間的相關(guān)性。
　　結(jié)果：FoxM1和COX-2在CRC組織中表達(dá)陽性率分別為85.3%（81/95）和87.4%（83/95），顯著高于正常結(jié)腸組織的7.5%（3/40）和12.5%（5/40）（P＜0.05）。FoxM1和COX-2的高表達(dá)與較多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及較晚的臨床分期均密切相關(guān)（P＜0.05），與但與腫瘤的浸潤(rùn)深度、是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無相關(guān)性（P>0.05），F(xiàn)oxM1和COX-2蛋白在CRC中的表達(dá)強(qiáng)度呈正相關(guān)（r=0.6