吊球草化學(xué)成分及生物活性研究.pdf

1、吊球草（Hyptis rhomboidea）為唇形科（Lamiaceae）山香屬（Hyptis）一年生草本植物，又被稱(chēng)作石柳,四儉草,四方骨,假走馬風(fēng),螭蜍蜊等等。吊球草在廣東作為民間用藥，用于治療或輔助治療肝炎、潰瘍、水腫。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)初篩，吊球草醇提物具有較好的抗腫瘤活性，且國(guó)內(nèi)外對(duì)該植物研究尚處于空白階段，所以本論文以吊球草為研究對(duì)象，主要研究工作如下：
　　目的：在活性追蹤下對(duì)吊球草進(jìn)行化學(xué)成分的系統(tǒng)研究。對(duì)吊球草粗提物、不同

2、的萃取部位及部分單體進(jìn)行抗氧化活性、抑菌活性、細(xì)胞毒活性以及體內(nèi)抗腫瘤活性的測(cè)定與評(píng)價(jià)；在生態(tài)學(xué)上研究其作為入侵植物的化感作用，為探討吊球草中的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用該資源提供參考依據(jù)。
　　方法：（1）對(duì)吊球草全草通過(guò)75％乙醇浸提，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，通過(guò)粗分得到總提物（A）、石油醚部位（B）、乙酸乙酯部位（C）、正丁醇部位（D），正丁醇部位通過(guò)大孔吸附樹(shù)脂Diaion HP-20柱色譜，依次用含水甲醇

3、洗脫，得到20%甲醇部位（E），40%甲醇部位（F）。對(duì) EtOAc部位通過(guò)硅膠柱色譜，用不同比例的石油醚-氯仿梯度洗脫，經(jīng)過(guò)反復(fù)柱色譜分離，分別得到Y(jié)5部位（G）、Y6-8部位（H）、Y6-9部位（I），Y7部位（J）；EtOAc部位采用Toyopearl HW-40,Sephadex LH-20,MCI-Gel CHP-20,RP-18,PTLC及硅膠等色譜法對(duì)吊球草的化學(xué)成分進(jìn)行反復(fù)分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和現(xiàn)代波譜解析技術(shù)（1H-

4、NMR，13C-NMR，UV，IR，MS，HMQC，HMBC譜等）鑒定化合物的結(jié)構(gòu)。分離鑒定出11個(gè)化合物，所有化合物均是首次從吊球草中分離得到。
　　（2）采用咸水蝦致死的生物活性測(cè)定法和抗腫瘤 MTT法對(duì)吊球草醇提物進(jìn)行細(xì)胞毒活性及抗腫瘤活性篩選，其中咸水蝦致死實(shí)驗(yàn)中以蒸餾水為陰性對(duì)照，結(jié)果以L(fǎng)C50（μg·mL-1）表示。MTT法采用肺癌（H1299）、大腸癌 Lovo，結(jié)直腸癌SW480）、惡性黑色素瘤（A2058）、肝癌

5、（PLC）細(xì)胞株，對(duì)吊球草總提物進(jìn)行體外抗腫瘤活性篩選，結(jié)果以 LC50（μg·mL-1）表示。采用吊球草乙醇提物高、中、低劑量（13，6.5，3.25 mg/10g）對(duì) ICR系荷H22腫瘤小鼠建立實(shí)體瘤、腹水瘤、免疫抑制模型，進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)。
　?。?）采用DPPH、FRAP、ABTS法對(duì)吊球草粗提物A~D，G~J部位進(jìn)行抗氧化活性測(cè)定，以 Trolox為陽(yáng)性對(duì)照，結(jié)果以 Trolox當(dāng)量(TEAC，mg/100g)表

6、示。
　　（4）采用2倍稀釋法，選用8種植物病原真菌（小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum,F.g)、大麥赤霉病菌(Fusarium graminearum Schwabe,F.gs)、黑根霉病菌(Rhizopus nigricans,R.n)、玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum,E.t)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum,F.o)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinere

7、a,B.c)、核盤(pán)病菌(Sclerotinia sclerotiorum,S.s)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary,S.sc)對(duì)吊球草粗提物A~J部位以及單體化合物1，4~6，10進(jìn)行抗真菌活性測(cè)定，結(jié)果以MIC表示。
　　（5）采用培養(yǎng)皿法和“小杯法”對(duì)吊球草莖、葉水浸液對(duì)八種農(nóng)作物種子（油菜、蘿卜、水稻、萵苣、綠豆、小麥、辣椒、黑麥草）進(jìn)行種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)研究，并

8、采用水浸液進(jìn)行咸水蝦致死實(shí)驗(yàn)，以蒸餾水為陰性對(duì)照，結(jié)果以L(fǎng)C50（μg·mL-1）。
　　結(jié)果：（1）從吊球草75%乙醇提取物乙酸乙酯部位共分離出11個(gè)化合物，分別為咖啡酸乙酯(1)、熊果酸(2)、齊墩果酸(3)、vanillactic acid(4)、迷迭香酸甲酯(5)、山奈酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、山奈酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)、冬青素A

9、(8)、β-香樹(shù)脂醇(9)、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(紫云英苷，10)、山奈酚-3-O-α-L-吡喃鼠李糖-5-烯-3β,4β-二醇(11)。所有化合物均首次從該植物中分離得到。
　　（2）咸水蝦致死的生物活性測(cè)定法中，A~D,G~J各部位的LC50(μg·mL-1)值分別為94.91,276.91,96.86,392.10,446.14,189.95,167.76μg·mL-1。采用 MTT法和肺癌（H1299）、大

10、腸癌（Lovo）、結(jié)直腸癌（SW480）、惡性黑色素瘤（A2058）、肝癌（PLC）細(xì)胞株，對(duì)吊球草乙醇提取物進(jìn)行體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)，吊球草醇提物對(duì)肺癌（H1299）、大腸癌（Lovo）、結(jié)直腸癌（SW480）、惡性黑色素瘤（A2058）、肝癌（PLC）的LC50μg·mL-1分別為8、18、23、12、50μg·mL-1。H22肝癌實(shí)體瘤模型中，吊球草乙醇提取物的高、中、低劑量組的抑瘤率分別為68.83%，59.24%，46.40%；

11、其中高、中劑量組均可使小鼠脾臟指數(shù)（SI）升高，與模型對(duì)照組相比差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），ELISA分析結(jié)果顯示，高、中劑量組能改善小鼠外周血 TNF-α,IL-2,ALT,AST含量，腫瘤切片染色結(jié)果顯示，模型組小鼠腫瘤細(xì)胞增生活躍，氣泡較多，CTX及高、中劑量組腫瘤細(xì)胞較為稀疏，氣泡較少。腹水瘤模型組中，高劑量組延長(zhǎng)小鼠生命時(shí)間比模型組平均20天，免疫抑制模型組中，高劑量組能提高小鼠的生存質(zhì)量。
　　（3）吊球草A~

12、D,G~J部位的抗氧化活性實(shí)驗(yàn)中，DPPH方法結(jié)果顯示H、I、C、A部位的TEAC值大于Trolox，H部位具有較好的抗氧化活性；ABTS方法結(jié)果顯示H、C、A部位的TEAC值大于Trolox，H部位具有較好的抗氧化活性；FRAP方法結(jié)果顯示H、I、A、C、J、D、E、G部位的TEAC值大于Trolox，H部位具有較好的抗氧化活性。
　?。?）抑菌活性實(shí)驗(yàn)表明：乙酸乙酯部位的細(xì)分部位對(duì)8種植物病原真菌的抑制作用明顯，主要對(duì)大、小麥

13、赤霉菌抑制明顯。測(cè)試的單體化合物（酚酸類(lèi)）對(duì)大部分病原菌具有較好的抑制作用?；衔?、4、5對(duì)大麥赤霉病菌、小麥赤霉病菌、玉米大斑病菌和核盤(pán)菌有抑制作用，其中以化合物1和5的抑制作用最強(qiáng)?；衔?僅對(duì)油菜菌核病菌有抑制作用,化合物10對(duì)玉米大斑病菌和油菜菌核病菌均有抑制效果。
　?。?）吊球草莖葉水浸提液對(duì)八種種子的化感作用有明顯差別，對(duì)萵苣、小麥呈促進(jìn)作用；對(duì)油菜、蘿卜、水稻、綠豆、辣椒及黑麥草呈抑制作用，對(duì)水稻和綠豆的抑制作用

14、明顯小于油菜、蘿卜、辣椒、黑麥草；油菜和蘿卜的相差不明顯，與辣椒和黑麥草相差明顯。即兩種水浸液對(duì)辣椒、黑麥草抑制作用最強(qiáng)，其次是油菜、蘿卜，再次是水稻、綠豆，且葉水浸液的化感抑制作用強(qiáng)于莖水浸液。
　　結(jié)論：（1）吊球草化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型主要為酚酸類(lèi)、黃酮類(lèi)及萜類(lèi)化合物。（2）吊球草乙醇提物在體外具有一定的細(xì)胞毒活性，體內(nèi)具有一定的抗腫瘤活性及提高免疫能力活性。
　?。?）吊球草乙醇提物具有較好的抗氧化活性，以乙酸乙酯部位的活