鋅硒拮抗二氧化硅毒性的細(xì)胞毒理學(xué)研究.pdf

1、二氧化硅(SiO2)是職業(yè)性肺部疾患中常見(jiàn)的致病因素。已有相當(dāng)多的實(shí)驗(yàn)表明，它不僅具有細(xì)胞毒性，而且有一定的遺傳毒性。 自1972年羅馬尼亞學(xué)者Gabor提出：用自由基和脂質(zhì)過(guò)氧化學(xué)說(shuō)來(lái)解釋肺巨噬細(xì)胞被游離SiO2破環(huán)開(kāi)始，氧化應(yīng)激在SiO2致毒過(guò)程中作用一直為人們所關(guān)注。外源性或內(nèi)源性因素引起活性氧族(ROS)和(或)活性氮族(RNS)產(chǎn)生增強(qiáng)和/或機(jī)體抗氧化能力減弱，過(guò)度的ROS和(或)RNS攻擊靶器官，造成組織器官和生物大

2、分子如DNA、RNA、蛋白質(zhì)的損傷，從而為后來(lái)疾病的發(fā)生和發(fā)展提供了基礎(chǔ)。此外，細(xì)胞間隙連接通訊(GJIC)在氧化應(yīng)激及SiO2致毒過(guò)程中也發(fā)揮了十分重要的作用。目前研究表明促癌劑、致癌物、癌基因和細(xì)胞生長(zhǎng)因子都可通過(guò)致GJIC功能下調(diào)，在細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)化畸變中發(fā)揮效應(yīng)。SiO2抑制細(xì)胞GJIC功能是其可能的非遺傳毒性致癌機(jī)制。而微量元素不僅是維生素、酶、蛋白質(zhì)、胰島素及核酸組成部分，還能引起人體結(jié)構(gòu)元素發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶系統(tǒng)特別是抗氧化

3、酶起著特異的活化中心作用，參與機(jī)體的激素發(fā)揮作用，與氨基酸構(gòu)成絡(luò)合物的成份影響核酸的代謝。眾多文獻(xiàn)報(bào)道Zn、Se等元素均不同程度地直接或間接保護(hù)細(xì)胞膜的作用，清除自由基，抗脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)。因此，合理使用Zn、Se等微量元素應(yīng)該有助于預(yù)防和治療SiO2引起的相關(guān)疾病。但是有些元素在量大時(shí)還可以引起機(jī)體的毒性反應(yīng)。鋅、硒等微量元素聯(lián)合應(yīng)用能否用于矽肺的防治?用何種劑量、何種配比才能達(dá)到最佳防治效果而毒性最小?目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)此類研究報(bào)道。

4、 在體外條件下，我們對(duì)葡萄糖酸鋅(ZnG)和亞硒酸鈉(Na2SeO3)拮抗SiO2的細(xì)胞毒性、遺傳毒性以及對(duì)細(xì)胞GJIC功能抑制進(jìn)行了研究。通過(guò)檢測(cè)加入ZnG和Na2SeO3的染SiO2粉塵肺泡巨噬細(xì)胞(AM)過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸脫氫酶(LDH)等生化指標(biāo)，觀察了ZnG

5、和Na2SeO3對(duì)染塵AM的膜通透性、自由基產(chǎn)生以及脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的影響。在ZnG和Na2SeO3拮抗SiO2致中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞(CHL)遺傳毒性的研究中，采用細(xì)胞微核試驗(yàn)(micronucleuistest，MNT)、單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)(singlecellgelelecrophoresis，SCGE)，從染色體水平和DNA水平探討了ZnG和Na2SeO3的單獨(dú)和聯(lián)合拮抗作用。通過(guò)劃痕染料示蹤技術(shù)(scrapeloadingand

6、dyetransfer，SLDT)，研究ZnG和Na2SeO3單獨(dú)及聯(lián)合作用對(duì)SiO2致CHL細(xì)胞GJIC功能下調(diào)的影響，探討ZnG、Na2SeO3拮抗SiO2對(duì)細(xì)胞GJIC功能影響的可能機(jī)制。 染塵巨噬細(xì)胞生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明：200mg/LSiO2與AM共同培養(yǎng)，可以引起培養(yǎng)液中LDH、AM的NOS活性增加，H2O2、NO、MDA含量增加以及GSH-Px、SOD、CAT的活性降低。單純ZnG和Na2SeO3在一定劑量下不引起

7、細(xì)胞生化指標(biāo)改變。ZnG和Na2SeO3分別具有拮抗SiO2致AM毒性的作用，使培養(yǎng)液中LDH、細(xì)胞NOS活性降低，H2O2、NO、MDA含量減少以及GSH-Px、SOD、CAT的活性升高，其中以分別加入2.25mg/LZnG和2.0μmol/LNa2SeO3各指標(biāo)變化最明顯。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，ZnG和Na2SeO3對(duì)各生化指標(biāo)影響的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：以1.5mg/L的ZnG與1.0μmol/L的Na2SeO3拮抗SiO2細(xì)

8、胞毒性聯(lián)合作用效果最好。極差分析表明，除了對(duì)染塵AM細(xì)胞MDA、H2O2和LDH這三個(gè)指標(biāo)ZnG的作用強(qiáng)于Na2SeO3外，Na2SeO3對(duì)染塵AM細(xì)胞其他生化指標(biāo)的影響均強(qiáng)于ZnG。 細(xì)胞微核試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：19.08μg/cm2的SiO2粉塵引起了CHL細(xì)胞微核率增加，單純ZnG和Na2SeO3在一定劑量下對(duì)CHL細(xì)胞微核率無(wú)明顯影響。分別加入不同濃度的ZnG(1.0、1.5、2.25mg/L)和Na2SeO3(0.5、1

9、.0、2.0μmol/L)可明顯降低染塵CHL的細(xì)胞微核率。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方差分析結(jié)果表明，ZnG和Na2SeO3單獨(dú)拮抗SiO2誘發(fā)細(xì)胞微核效應(yīng)三水平間的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而兩者拮抗SiO2誘發(fā)細(xì)胞微核效應(yīng)的交互作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 采用單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)檢測(cè)ZnG和Na2SeO3對(duì)SiO2致DNA損傷作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：不同劑量SiO2粉塵(25～200mg/L)對(duì)CHL的DNA損傷呈劑量依賴性，隨著作用劑量的增加，DNA

10、的損傷逐漸加重。單純ZnG和Na2SeO3在一定劑量下對(duì)CHL細(xì)胞DNA無(wú)明顯損傷作用。分別加入不同濃度的ZnG(1.0、1.5、2.25mg/L)和Na2SeO3(0.5、1.0、2.0μmol/L)可明顯降低染塵CHL的細(xì)胞DNA損傷作用。ZnG和Na2SeO3拮抗SiO2致細(xì)胞DNA損傷的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：以2.25mg/L的ZnG與0.5μmol/L的Na2SeO3聯(lián)合作用效果最好，且Na2SeO3對(duì)SiO2細(xì)胞DNA彗星形

11、成的拮抗作用強(qiáng)度明顯強(qiáng)于ZnG，而對(duì)于彗星尾長(zhǎng)的影響ZnG的作用強(qiáng)度稍強(qiáng)于Na2SeO3。 為了解ZnG和Na2SeO3對(duì)SiO2致GJIC功能抑制的影響，我們借助劃痕染料示蹤技術(shù)檢測(cè)加入ZnG和Na2SeO3的染塵CHL細(xì)胞GJIC功能。結(jié)果表明：不同濃度SiO2粉塵(50～200mg/L)對(duì)CHL細(xì)胞GJIC功能的抑制呈濃度依賴性，隨著作用濃度的增加，細(xì)胞GJIC功能的抑制逐漸加重。單純ZnG和Na2SeO3在一定劑量下不影

12、響CHL細(xì)胞GJIC功能。分別加入不同濃度的ZnG(1.5、2.25mg/L)和Na2SeO3(0.5、1.0、2.0μmol/L)可明顯提高細(xì)胞GJIC功能。正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果表明，ZnG和Na2SeO3拮抗SiO2致細(xì)胞GJIC功能下調(diào)的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：以1.5mg/L的ZnG與2.0μmol/L的Na2SeO3聯(lián)合作用效果最好。極差分析表明，Na2SeO3對(duì)染塵CHL細(xì)胞GJIC功能的影響強(qiáng)于ZnG。 以上結(jié)果表明

13、，ZnG和Na2SeO3對(duì)SiO2致細(xì)胞毒性、遺傳毒性以及GJIC功能抑制有一定的拮抗作用。ZnG和Na2SeO3單獨(dú)作用可拮抗SiO2致AM細(xì)胞毒性、CHL遺傳毒性以及細(xì)胞GJIC功能抑制，除拮抗SiO2誘發(fā)細(xì)胞微核效應(yīng)的交互作用沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，ZnG和Na2SeO3聯(lián)合作用時(shí)拮抗SiO2致AM細(xì)胞毒性、CHL細(xì)胞DNA損傷以及細(xì)胞GJIC功能抑制作用更加明顯，其交互作用具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但對(duì)于不同的研究指標(biāo)，要達(dá)到最佳的聯(lián)合作用效果