中國HIV感染者-艾滋病患者免疫學特征與疾病進展關系的研究.pdf

1、目的：人類免疫缺陷病毒(HIV)是艾滋病(AIDS)的病原體，主要侵犯CD4+T細胞，人體感染HIV后因各種機會性感染及惡性腫瘤而死亡。我國HIV感染者IL-7水平及與疾病進展的相關性研究目前還是空白。本研究擬采用流式細胞儀胞內染色、表面染色法法及ELISA法，首次對中國HIV/AIDS患者NK細胞及CD8+T淋巴細胞內穿孔素表達水平CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞的增殖反應頻率、以及血漿IL-7水平進行了檢測，并探討了這些指標與

2、疾病進展及免疫功能的相關性。 主要方法：1.研究對象實驗對象來自中國醫(yī)科大學艾滋病研究所確認實驗室以及遼寧省、吉林省、黑龍江省疾病預防控制中心確認實驗室經Westernblot確認陽性的HIV/AIDS患者。HIV抗體陰性的健康對照來自本院健康體檢門診的體檢者。 2.T淋巴細胞絕對值計數(shù)將20μlCD4/CD8/CD3TriTEST試劑加入CD4絕對計數(shù)管中，加入50μLlEDTA抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血

3、素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算CD4+、CD8+、CD3+T淋巴細胞絕對值及相應比值等。 3.病毒載量檢測采用RT-PCR方法，用美國Roche公司的COBASAMPLICOR自動載量儀測定血漿病毒載量，最低檢測限為400拷貝/毫升。 4.NK細胞絕對值和比值測定將20μlTriTESTCD3FITC/CD56CD16PE/CD45PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，加

4、入50μlEDTA抗凝血，室溫避光15min，加入免洗溶血素450μl，室溫避光15min，F(xiàn)ACSMULTISET軟件檢測并進行自動分析，計算NK細胞絕2對值及相應比值等。 5.胞內染色檢測CD8+T細胞、NK細胞內穿孔素表達取100ul肝素鈉抗凝全血，加2-3ml1×FACS溶血素裂解紅細胞，洗一次，加0.5mlcytofix/perm避光固定通透20min，再加2mlcytoperm/wash避光通透10min，100ul

5、cytoperm/wash重懸，加CD3FITC/CD8PerCP、CD3FITC/CD16PerCP及CD56FITC/CD3PerCP各6ul及perforin-PE、perforin-isotype各20ul避光染色30min，2mlcytoperm/wash洗一次后上機分析。 6.T淋巴細胞增殖反應參照Boritz法[16]，采集肝素鈉抗凝血10ml，提取PBMC(濃度為2×106/ml)，取500μl(含10％胎牛血清

6、RPMI1640)加入48孔培養(yǎng)板，加HIV-1Gag抗原0.5μl，CD28單抗、CD49d單抗各1μl，Monesin0.35μl，健康對照不加HIV-1Gag抗原，37℃、5％CO2孵育過夜，培養(yǎng)結束前1小時加10μl/ml的BrdU至結束。T淋巴細胞增殖反應按試劑說明檢測，收集HIV-1Gag特異性T淋巴細胞于流式管，加CD4-PE、CD3-PerCP各6μl，冰上避光15min；100μlcytofix/perm緩沖液重懸細胞

7、，冰上避光20min；100μlcytopermplμs重懸，冰上避光10min；100μlcytofix/perm緩沖液重懸再固定，冰上避光5min；100μDNase重懸，37℃孵育1小時；1μlFITC-BrdU單抗室溫避光染色20min，流式細胞儀分析實驗結果。 主要結果：1.HIV感染組及HAART組NK細胞、CD8+T細胞內穿孔素表達水平我們應用流式細胞儀胞內染色法，對31例未經抗病毒治療的HIV感染者、17例經HA

8、ART治療的HIV/AIDS患者及15例健康對照者的NK細胞、CD8+T細胞內穿孔素水平進行了檢測，結果顯示：HIV感染組CD3-/CD16+、CD56+/CD3-NK細胞的穿孔素表達顯著低于健康對照(P＜0.05；P＜0.05)；CD8+T細胞穿孔素表達顯著高于健康對照組(P＜0.05)。HAART組CD3-/CD16+、CD56+/CD3-NK細胞的穿孔素表達較HIV感染組顯著增高(P＜0.05；P＜0.05)，與健康對照組差異不顯

9、著；HAART組CD8+T細胞穿孔素表達(平均7.92％)低于HIV感染組(平均9.03％)，兩者的差異不顯著。 2.影響HIV感染組NK細胞CD8+T細胞內穿孔素表達的相關因素將HIV感染組CD3-/CD16+、CD56+/CD3-NK細胞及CD8+T細胞的穿孔素表達與CD4+T、CD8+T淋巴細胞絕對值、血漿病毒載量及NK細胞絕對值、NK細胞百分數(shù)進行相關性分析，結果顯示：CD3-/CD16+、CD56+/CD3-NK細胞兩

10、個亞群的穿孔素表達與NK細胞絕對值正相關(r=0467，P＜0.01)(r=0.488，P＜0.01)，與NK細胞百分數(shù)呈正相關(r=0.300，P＜0.05)(r=0.501，P＜0.01)，與CD4+T、CD8+T淋巴細胞絕對值及病毒載量均不相關；CD8+T細胞內穿孔素表達與CD8絕對計數(shù)正相關(r=0.384，P＜0.05)，與CD4絕對計數(shù)、NK細胞絕對值、NK細胞百分數(shù)及病毒載量均4不相關。 3.中國HIV感染者HIV

11、-1Gag特異性T淋巴細胞增殖反應我們應用BrdU摻人的流式胞內染色法，對中國HIV感染者HIV-1Gag特異性T淋巴細胞增殖反應進行了檢測，結果顯示：健康對照組、HIV感染組及AIDS組的HIV-1Gag特異性CD4+T細胞增殖率依次減低，HIV感染組及AIDS組均顯著低于健康對照組(P＜0.001，P＜0.001)，AIDS組顯著低于HIV感染組(P＜0.01)；健康對照組、HIV感染組及AIDS組的HIV-1Gag特異性CD8+T

12、細胞增殖率依次增高，除HIV感染組與健康對照組差異不顯著(P＞0.05)外，AIDS組與HIV感染組及健康對照組間差異均顯著(P＜0.001；P＜0.001)。 4.中國HIV感染者T淋巴細胞的活化狀態(tài)以及與T淋巴細胞增殖反應相關性 HIV感染者CD8+T細胞活化程度(平均為43.31％)顯著高于健康對照(平均為25.92％)(P＜0.001)，CD4+T細胞活化程度與健康對照無明顯差異(P＞0.05)(結果未顯示)。將

13、HIV-1Gag特異性CD4+T、CD8+T淋巴細胞增殖率與CD8+T細胞上CD38表達率進行相關分析顯示：HIV-1Gag特異性CD4+T細胞增殖率與CD8+T細胞CD38表達呈負相關(r=-0.416；P＜0.01)，HIV-1Gag特異性CD8+T細胞增殖率與CD8+T細胞CD38表達正相關(r=0.594；P＜0.01)。 5.中國HIV感染者T淋巴細胞增殖反應與疾病進展的相關性以CD4絕對值和血漿病毒載量代表疾病進展，

14、與HIV-1Gag特異性CD4+、CD8+T細胞增殖率進行相關分析，可見HIV-1Gag特異性CD4+T細胞增殖率與CD4絕對值顯著正相關(r=0.435；P＜0.01)，與血漿病毒載量負相關(r=-0.486；P＜0.05)；HIV-1Gag特異性CD8+T細胞增殖率與CD4絕對值顯著負相關(r=-0.691；P＜0.01)，與血漿病毒載量不相關(r=0.556；P=0.160)。此外，HIV-1Gag特異性CD4+T細胞增殖率與CD

15、8+T細胞增殖率間無明顯相關性(r=-0.144；P=0.415)。 結論：1.中國HIV/AIDS患者NK細胞表達穿孔素低于健康對照，HAART治療組NK細胞穿孔素表達升高，NK細胞內穿孔素表達與NK絕對計數(shù)及NK細胞百分數(shù)呈顯著正相關，提示HIV感染中NK細胞功能受損，抗病毒治療可恢復其功能。 2.中國HIV/AIDS患者CD8+T細胞穿孔素表達高于健康對照，與CD8+T細胞絕對計數(shù)顯著正相關，HAART治療可降低其

16、表達，提示HIV感染中CD8+T細胞功能增強。 3.中國HIV/AIDS患者HIV-1Gag特異性CD4+T細胞增殖率顯著低于健康對照，與CD4絕對值正相關，與血漿病毒載量負相關，與CD8+T細胞CD38表達負相關，提示中國HIV/AIDS患者HIV特異性CD4+T細胞增殖功能減低，其反應頻率可作為評價HIV感染者免疫功能及預測疾病進展的標志之一。 4.中國HIV/AIDS患者HIV-1Gag特異性CD8+T細胞增殖率顯