輻射致AHH-1旁效應差異表達基因信息學分析及部分基因研究.pdf

1、研究內容: 1．基因芯片檢測出不同劑量60Coγ射線照射人淋巴母細胞(AHH-1)及與其共同培養(yǎng)未照射細胞差異表達基因譜。利用生物信息學方法分析篩選輻射旁效應相關差異表達基因。 2．對候選輻射相關和旁效應相關的基因進行分子生物學驗證，得到的陽性結果進一步分析功能和可能在輻射效應或旁效應中的作用，探尋可能的存在的機制。 研究方法: 1．芯片數(shù)據(jù)的生物信息學分析方法主要是使用生物信息學軟件、在線軟件和網(wǎng)絡數(shù)據(jù)

2、庫對數(shù)據(jù)進行聚類分析、功能分析、序列比對和進化樹的構建。 2．重復芯片樣品準備，生物學驗證主要使用PCR的方法檢測樣品中各基因RNA的表達量。 3．照射細胞和旁效應細胞長期培養(yǎng)、加入磷酸化抑制劑，檢測蛋白活性的變化。 4．統(tǒng)計學方法：單樣本t檢驗、單因素方差分析 結果: 1．γ射線直接照射細胞及其旁效應細胞基因表達譜： 與正常對照組比較：2.0Gy旁效應細胞(P2.0)中有上調基因107個

3、，下調基因6個；0.5Gy旁效應細胞(P0.5)中有上調基因57個，下調基因8個；2.0Gy直接照射細胞(Z2.0)中有上調基因90個，下調基因349個；0.5Gy直接照射細胞(Z0.5)中有上調基因67個，下調基因29個．其中17個基因表達隨劑量增大而增大，6個基因低劑量下調而高劑量和共培養(yǎng)細胞上調：分析僅在Z0.5變化的基因在P0.5中變化明顯，提示旁效應的產生與照射劑量有關。 2．聚類分析結果： 篩選的差異表達基因

4、在GO功能分類中細胞膜蛋白、細胞聯(lián)接、周期相關和物質轉運蛋白占了絕大部分，同時它們參與了轉錄、翻譯、細胞周期、離子轉運、細胞凋亡、氧化還原、氧化磷酸化等功能模塊。研究者認為細胞受到低劑量照射的刺激后并非直接死亡，卻間接刺激了膜分泌和細胞間通訊。 3．Z0.5和P0.5均明顯變化的基因： BAX，ZNF652，GINS4，F(xiàn)OS，AP1S1，PTPRJ(CD148，PTP受體家族的一種酩氨酸磷酸酶)在Z0.5和P0.5表

5、達均明顯變化。表明這些基因與低劑量照射生物學效應發(fā)生有關。進化樹中可以看出GINS4(目前GINS4還無G0分類)和ZNF652(鋅指蛋白652)距離較近，AP1S1(AP-1家族網(wǎng)格蛋白(Clathrin)的一種)和他們也相近，AP1S1、GINS4和ZNF652在結構和功能上可能有某種聯(lián)系，且四個均與基因轉錄調控、細胞分泌有關，只有BAX(Bcl-2相關蛋白x)的五種蛋白和他們距離較遠說明他們發(fā)生相互作用的可能性很小， 4．

6、與照射劑量關系不大的蛋白序列比對結果： 一些基因在0.5Gy照射和2Gy照射均發(fā)生變化，我們將這些基因所表達的蛋白進行多序列比，果均顯示PAPLN(原腸(胚)形成糖蛋白)與假定蛋白LOC375010距離較近，并且與BAX的5種蛋白較遠，提示PAPLN和LOC375010在結構和功能上可能有某種內在聯(lián)系。 5．多種鋅指蛋白在直接照射細胞和旁效應細胞表達變化：在芯片結果中我們發(fā)現(xiàn)多種鋅指蛋白在直接照射細胞和旁效應細胞表達變化

7、．發(fā)現(xiàn)ZNF423同家族的成員參與了生長因子TGF-β的信號通路，同時在芯片數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)鋅指蛋白家族ZC3H7A參與了TGF-β1信號通路；受到2Gy照射后上調2.2倍，編碼TGF-β1的基因在受到2Gy照射后也上調1.8倍。 6．對功能未知差異表達基因的生物信息學分析結果： 對一些還無分類，功能未知的差異表達基因在NCBI上BLAST未發(fā)現(xiàn)相似度較高的信息。發(fā)現(xiàn)候選癌基因CACS4與假定蛋白LOC375010距離較近，可

8、能在功能上有某種聯(lián)系． 7．可能與輻射誘導的旁效應關系密切的基因功能分析 根據(jù)芯片數(shù)據(jù)聚類結果和基因信息查詢結果，發(fā)現(xiàn)一些細胞通路中重要的基因，通過網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)很多差異表達基因在TP53相關細胞周期通路、BAX相關凋亡通路和TGF-β信號通路中。 8．通過對芯片分析篩選基因中15個目前還未報道與輻射或旁效應相關的候選基因驗證實驗發(fā)現(xiàn)，表達均有顯著改變。 8.1跨膜相關的差異表達基因：PTPRJ、PAPL

9、N和VDAC3(電壓門控通道3)；PTPRJ在低劑量直接照射和旁效應細胞中表達明顯下調(P＜0.05)，RT-PCR也驗證了它的下調，在2.0Gy直接照射細胞中也有明顯下調(P＜0.05)。PAPLN照射以后上調而旁效應無明顯變化，驗證實驗確發(fā)現(xiàn)照射后明顯下調。VDAC3旁效應細胞中RNA表達變化與芯片數(shù)據(jù)一致，其對于低劑量和高劑量輻射反映呈相反趨勢，在低劑量直接照射和旁效應細胞中表達明顯下調，在高劑量直接照射和旁效應細胞中表達明顯上調

10、。 8.2胞內物質轉運相關的基因：AP1S1，PDP2(丙酮酸脫氫磷酸酶2)；AP1S1 RNA表達在直接照射組細胞變化不顯著，而在旁效應細胞中表達顯著增高(P＜0.05)，并隨著劑量增加而增加，與芯片結果一致。PDP2在Z0.5和P0.5上調，Z2.0下調明顯，與芯片一致；而在P2.0細胞中卻沒有顯著變化 8.3核內轉錄調節(jié)，與細胞周期凋亡相關的差異表達基因：ZNF652、FOS、TPR、ZMAT3(P53相關鋅指蛋白

11、)、CFLAR；qPCR結果顯示ZNF652在Z0.5，P0.5中明顯上調(P＜0.05)，與芯片一致，Z2.0也有明顯上調(P＜0.05)。FOS在Z2.0細胞中RNA與芯片數(shù)據(jù)一致，無明顯表達變化，Z0.5，P0.5，P2.0變化沒有芯片顯著，但是也都明顯下調(P＜0.05)。TPR照射細胞中RNA表達變化與芯片數(shù)據(jù)一致，在Z0.5細胞中表達下調(P＜0.05)。ZMAT3在Z0.5，P0.5，P2.0細胞中RNA表達變化與芯片數(shù)據(jù)

12、一致，在0.5Gy和2Gy照射均有上調(P＜0.05)，并且0.5Gy上調較明顯；CFLAR在Z2.0，P0.5，P2.0細胞中RNA表達變化與芯片數(shù)據(jù)一致．在Z2.0細胞中明顯下調，而Z0.5和P0.5旁效應細胞中卻明顯上調(P＜0.05)， 8.4差異表達的未知基因：LOC375010、C120rf5(染色體開放讀框，又名TIGAR)、GINS4(GIN蛋白復合體4)；LOC375010在Z2.0細胞中RNA表達明顯上調(P

13、＜0.05)，在旁效應中變化比芯片顯著，有上調趨勢。C12orf5在其他發(fā)表的輻射相關芯片數(shù)據(jù)中也發(fā)現(xiàn)有下調，我們芯片數(shù)據(jù)中在Z2.0有明顯下調，RT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)Z2.0確實有明顯下調(P＜0.05)，而Z0.5和P0.5卻上調明顯，P2.0下調。 9．Caspase8(半胱氨酸蛋白水解酶8)檢測 照射和旁效應細胞中Caspase8活性有降低的現(xiàn)象，多次相同劑量照射均有明顯降低(P＜0.05)，但是加入磷酸化抑制劑后

14、這種變化消失(各樣本中)，Caspase8酶活性均降為同一水平。細胞培養(yǎng)30天后發(fā)現(xiàn)照射細胞Caspase8酶活性增加(P＜0.05)，而旁效應細胞中卻無明顯改變。 結論: 1．γ射線直接照射細胞可導致與其共同培養(yǎng)的旁效應細胞產生眾多差異表達基因。發(fā)現(xiàn)一些基因在各劑量組照射細胞中均發(fā)生變化，提示這些基因的變化可能在一定劑量范圍內與照射劑量關系不大；一些基因的變化在一定劑量范圍內直接和間接照射效應相似，提示旁效應的產生與可

15、能照射劑量有關。 2．從聚類結果可以發(fā)現(xiàn)差異表達基因中細胞連接通訊占很大部分；旁效應研究者認為細胞受到低劑量照射的刺激后并非直接死亡，卻間接刺激了膜分泌和細胞間通訊。這些數(shù)據(jù)結果和輻射誘導旁效應的觀點相吻合。一些細胞通路中出現(xiàn)的重要的差異表達基因，很可能參與到輻射旁效應機制中。部分磷酸酶受體分子的下調可能與低劑量輻射反應信號因子傳遞有關。 3．多序列比對發(fā)現(xiàn)一些可能有相互作用的差異表達基因，它們的核酸或蛋白序列距離較近。

16、對未知基因的分析與驗證，可能有助于新功能的發(fā)現(xiàn)和低劑量輻射機制的深入研究。 4．驗證結果大部分與芯片數(shù)據(jù)一致，表明這些基因在照射或旁效應機制中可能起了重要作用。AP1S1，F(xiàn)OS(一個FBJ病毒癌基因，可抑制癌細胞的遷移)，TPR和膜通道蛋白VDAC3，PTPRJ在旁效應細胞中改變與芯片一致，可能與低劑量輻射反應信號因子傳遞有關，ZNF652照射和旁效應中的反應和腫瘤細胞相反，表達上調結合抑瘤基因的功能增強，ZMAT3也同樣上調

17、，他們可能在DNA損傷的修復過程中起作用，有進一步深入研究的價值。 5．照射細胞和旁效應細胞中Caspase8酶活性有降低的現(xiàn)象(P＜0.05)，加入磷酸化抑制劑以后這種變化消失，Caspase8酶活性均降為同一水平?？赡芤驗榈蛣┝康碾婋x輻射及其誘導的旁效應可以誘導凋亡相關蛋白的上調(BAX，CFLAR，ZMAT3，TIGAR等)，這些蛋白作用于被激活的Caspase8或P53通路，使得Caspase8活性下降。而加入磷酸化抑制