輻射后HepG2細胞IER5與Cdc25B啟動子的相互作用.pdf

1、目的:原發(fā)性肝癌是世界第五大惡性腫瘤，在癌癥相關死亡原因中排名第三。目前，臨床上常用的治療原發(fā)性肝癌的方法有射頻消融治療、肝動脈栓塞化療、無水乙醇注射治療、放療等，但療效欠佳，這很大程度上歸因于肝癌的異質性。放療是惡性腫瘤治療的主要手段之一，如何提高肝癌的輻射敏感性是提高肝癌放療療效的關鍵。因此人們一直致力于尋找肝癌的輻射敏感基因。IER5基因屬于慢動力基因組，電離輻射可誘導多種腫瘤細胞IER5表達上調(diào)，我們的前期研究結果顯示:抑制IE

2、R5表達能促進肝癌HepG2細胞及宮頸癌Hela細胞增殖，增強其抗輻射能力，降低其輻射敏感性;增加IER5表達能抑制HepG2和Hela細胞生長、增殖與分裂，促進細胞凋亡，削弱其抗輻射能力，增強其輻射敏感性。說明IER5基因在肝癌、宮頸癌等惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮一定作用，IER5基因參與了肝癌及宮頸癌輻射敏感性的調(diào)節(jié)，作用類似于p53等抑癌基因。細胞周期(cell cycle)，是指能持續(xù)分裂的真核細胞從一次有絲分裂結束后生長，再到下一次分

3、裂結束的循環(huán)過程。癌變的細胞以及特定階段的胚胎細胞常常有異常的分裂周期。Cdc25磷酸酶是一種雙特異磷酸酶，是細胞周期的重要調(diào)控元件。Cdc25磷酸酶有三個亞型:Cdc25A，Cdc25B和Cdc25C。研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤組織中Cdc25B表達增加，多數(shù)研究認為Cdc25B過表達促進了腫瘤的發(fā)生。Cdc25B啟動子分析顯示p53通過與Cdc25B的啟動子相結合抑制Cdc25B表達，從而抑制了腫瘤的發(fā)生。目前國外研究發(fā)現(xiàn)在急性淋巴細胞白血

4、病細胞中IER5通過與Cdc25B啟動子相結合來抑制其表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。IER5在肝癌HepG2細胞中是否也通過與Cdc25B啟動子相結合來發(fā)揮其抑癌基因的作用，目前國內(nèi)外未見報道，本研究以HepG2細胞為研究對象，采用RT-PCR、半定量PCR、瞬時轉染、染色質免疫共沉淀、熒光素酶報告基因等方法研究IER5與Cdc25B間的相互作用。進一步探討IER5基因在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用及作用機制，期望為肝癌的分子靶向治療提供新的靶

5、點。
　　方法:1采用實時定量PCR方法檢測4Gy Co60γ射線照射后HepG2細胞IER5及Cdc25B mRNA表達的時間效應關系。2采用瞬時轉染技術降低HepG2細胞IER5表達，采用半定量PCR方法檢測Cdc25B mRNA含量，研究抑制IER5表達對4Gy Co60γ射線照射后Cdc25B mRNA表達的影響。3采用染色質免疫共沉淀方法分別于4Gy Co60γ射線照射后0、2、4、6、8h，檢測HepG2細胞IER5蛋

6、白與Cdc25B啟動子結合的變化。4構建Cdc25B啟動子重組質粒，采用熒光素酶報告基因技術分析4Gy Co60γ射線照射后IER5對HepG2細胞Cdc25B啟動子轉錄活性的影響。
　　結果:
　　1、輻射后HepG2細胞IER5和Cdc25B mRNA表達的變化:4Gy Co60γ射線照射后0、1、2、4、8、12h檢測HepG2細胞IER5及Cdc25B mRNA的含量，結果顯示:IER5 mRNA于照射后2h較未照射

7、時(0h)明顯增加，同時Cdc25B mRNA表達開始下降，照射后4h Cdc25B mRNA明顯低于未照射時，兩者間呈相反的變化趨勢，提示IER5可能存在抑制Cdc25B表達的作用。
　　2、抑制IER5表達對輻射調(diào)控Cdc25B mRNA表達的影響:4Gy Co60γ射線照射后，與對照HepG2細胞相比，IER5低表達細胞Cdc25B mRNA含量無明顯下降，說明抑制IER5表達削弱了輻射對Cdc25B表達的抑制作用，提示輻射

8、可能通過增加IER5的表達來抑制Cdc25B的表達，發(fā)揮抗腫瘤作用。
　　3、輻射后HepG2細胞IER5蛋白與Cdc25B啟動子間的作用:4Gy Co60γ射線照射HepG2細胞后0、2、4、6、8h收集細胞，采用交聯(lián)染色質免疫共沉淀技術檢測IER5蛋白與Cdc25B啟動子結合的變化。結果顯示:輻射后4h IER5蛋白與Cdc25B啟動子結合顯著性增多，且隨著IER5表達增加二者結合進一步增多，說明IER5通過競爭性結合Cdc2

9、5B啟動子發(fā)揮抑制Cdc25B表達的作用。
　　4、輻射后抑制IER5表達對Cdc25B啟動子活性的影響:應用熒光素酶報告基因方法，構建Cdc25B啟動子重組質粒，分別包含靶啟動子片段(-911,+105)、(-575,+105)、(-227,+105)、(-122,+105)和(-51，+105)。將五種不同的Cdc25B啟動子重組質粒與shIER5質?；蚩蛰d質粒共同轉染HepG2細胞，IER5低表達細胞（轉染shIER5質粒）

10、為實驗組，轉染空載質粒者為對照組，4Gy Co60γ射線照射后檢測熒光素酶活性。結果顯示:照射前，分別轉染(-911，+105)、(-575，+105)、（-227，+105）、(-122，+105)四種啟動子片段的實驗組較對照組Cdc25B啟動子轉錄活性明顯增加，而轉染（-51，+105）片段的實驗組與對照組間啟動子活性無明顯差異，說明抑制IER5表達增加了Cdc25B啟動子的轉錄活性，且(-51，+105)片段中未包含IER5的作用

11、位點，其作用位點可能在(-122，-51);照射后，分別轉染五種不同啟動子重組質粒的實驗組與對照組間Cdc25B啟動子轉錄活性的無明顯差異，提示輻射上調(diào)IER5表達后，實驗組與對照組啟動子轉錄活性的差異消失，再次說明IER5對Cdc25B啟動子的轉錄活性有抑制作用。
　　結論:輻射誘導HepG2細胞IER5表達增加，IER5可能通過競爭性結合Cdc25B啟動子，抑制Cdc25B啟動子轉錄活性，下調(diào)Cdc25B表達，從而發(fā)揮其抑癌基