核仁蛋白PICT-1在核糖體應(yīng)激下對(duì)MDM2-P53信號(hào)通路及腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、第一章PICT-1是一個(gè)與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核仁蛋白，PICT-1作為MDM2的E3泛素化底物在外源性核糖體應(yīng)激下通過泛素-蛋白酶體途徑被降解
　　 目的:篩選新的能與鼠雙微基因2(The murine double minute，MDM2)酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的蛋白質(zhì)，以進(jìn)一步明確該結(jié)構(gòu)域在MDM2對(duì)P53負(fù)性調(diào)節(jié)中的作用機(jī)制，同時(shí)探索MDM2與第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因(phosphatase and t

2、ensin homologdeleted on chromosome ten，PTEN)羧基末端結(jié)合蛋白-l(Proteininteracting with PTEN carboxy terminus-1，PICT-1)的相互作用關(guān)系。
　　 方法:應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)，以MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域?yàn)檎T餌，篩選人腦cDNA文庫(kù)，探索能與之結(jié)合的蛋白，應(yīng)用免疫共沉淀技術(shù)對(duì)候選蛋白質(zhì)PICT-1與MDM2結(jié)合的能力進(jìn)行確認(rèn);核苷酸分析軟件對(duì)

3、PICT-1功能區(qū)進(jìn)行分析;westem blotting技術(shù)用于比較PICT-1蛋白在不同組織來源的正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的表達(dá)差異;免疫熒光及western blotting技術(shù)探索PICT-1蛋白對(duì)于各種放化療藥物的應(yīng)答反應(yīng)并分析外源性核糖體應(yīng)激條件下PICT-1蛋白被降解的分子生物學(xué)特征。用泛素化失活的MDM2 C464A點(diǎn)突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞及采用MDM2和P53雙敲除的鼠成纖維細(xì)胞研究MDM2蛋白E3泛素化活性在PICT-1降解

4、過程中所起的作用。
　　 結(jié)果:包括PICT-1在內(nèi)的20種蛋白質(zhì)在酵母雙雜交系統(tǒng)中能與MDM2的酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合，PICT-1與MDM2結(jié)合的能力被免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，PICT-1蛋白從氨基酸147至羧基尾端為與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的區(qū)域。PICT-1是一個(gè)具有典型PEST結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核仁內(nèi)蛋白質(zhì)，在肺癌、乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞中PICT-1蛋白表達(dá)量較正常細(xì)胞為低。在外源性核糖體應(yīng)激條件下:一，PICT-1從核仁中位移至細(xì)胞核

5、，表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性的降解，這種降解可被蛋白酶體途徑抑制劑MG132所阻斷;二，MDM2泛素化失活的C464A點(diǎn)突變能使PICT-1的這種降解作用消失;三，PICT-1在野生型鼠成纖維細(xì)胞中被降解，卻不能在MDM2和P53雙敲除的鼠成纖維細(xì)胞中被降解。
　　 結(jié)論:
　　 (1) PICT-1是一個(gè)能與MDM2酸性結(jié)構(gòu)域結(jié)合的核仁內(nèi)蛋白質(zhì);
　　 (2) PICT-l作為MDM2泛素化底物在外源性核糖體應(yīng)激條

6、件下通過泛素-蛋白酶體途徑被特異性降解。
　　 第二章過表達(dá)PICT-1對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響及其機(jī)制研究
　　 目的:研究過表達(dá)PICT-1對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響及其機(jī)制。
　　 方法:采用細(xì)胞克隆集成能力及生長(zhǎng)曲線方法研究過表達(dá)PICT-1蛋白對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞及其他癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，采用免疫熒光及western blotting研究過表達(dá)PICT-1蛋白對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)影響的作用機(jī)制。
　　 結(jié)果:過表達(dá)PICT-

7、1可抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549(P53wt&pten wt)及及乳腺癌細(xì)胞MCF7(P53 wt&pten wt)的生長(zhǎng)，但在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299(P53 null& pten mutant)、骨肉瘤細(xì)胞U20S（P53 wt&pten null）及前列腺癌細(xì)胞PC3(P53 null& pten null)中表現(xiàn)不明顯，PICT-1過表達(dá)可通過抑制MDM2對(duì)P53的E3泛素化連接酶活性，繼而穩(wěn)定并激活P53蛋白。無論在有無P5

8、3的情況下，PICT-1蛋白過表達(dá)均能通過其羧基端穩(wěn)定MDM2，提示這種穩(wěn)定作用是P53轉(zhuǎn)錄活性非依賴性的。同時(shí)PICT-1可誘導(dǎo)MDM2從細(xì)胞核分布至細(xì)胞核仁中，使其失去與P53蛋白的作用機(jī)會(huì)。過表達(dá)PICT-l使抑癌蛋白ARF的半衰期由6小時(shí)延長(zhǎng)為10小時(shí)。PICT-1蛋白過表達(dá)可穩(wěn)定PTEN蛋白;在外源性核糖體應(yīng)激的條件下，同時(shí)過表達(dá)PTEN和PICT-1，二者可共同定位于細(xì)胞核中。
　　 結(jié)論:
　　 (1)過表

9、達(dá)PICT-1通過抑制MDM2對(duì)P53蛋白的泛素化連接酶活性，穩(wěn)定并激活P53蛋白，抑制非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞及乳腺癌MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)
　　 (2)過表達(dá)PICT-1還可以誘導(dǎo)MDM2分布至細(xì)胞核仁，延長(zhǎng)ARF的半衰期，增強(qiáng)PTEN蛋白穩(wěn)定性，是一個(gè)功能多樣的抑癌蛋白。
　　 (3)過表達(dá)PICT-1對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用在不同細(xì)胞中表現(xiàn)不同，可能與P53及PTEN等蛋白表達(dá)狀態(tài)密切相關(guān)。
　　 第三章慢病毒介導(dǎo)

10、的PICT-1沉默抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)機(jī)制研究
　　 目的:探討慢病毒介導(dǎo)的PICT-1沉默對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并闡明其作用機(jī)制。
　　 方法:采用兩個(gè)不同靶序列構(gòu)建慢病毒shRNA載體特異性沉默PICT-1，并以鼠源PICT-1挽救實(shí)驗(yàn)確認(rèn)其特異性。以sh GFP為陰性對(duì)照，RT-PCR檢測(cè)PICT-1、P53及PTEN mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測(cè)MDM2、P53、P21、B23及PTEN及磷酸化AKT蛋白

11、含量，Western blot檢測(cè)MDM2半衰期變化及外源性核糖體應(yīng)激下同時(shí)沉默PICT-1時(shí)MDM2、P53、P21蛋白含量，luciferase assay檢測(cè)各個(gè)分子信號(hào)通路活性，免疫熒光法檢測(cè)B23蛋白分布變化及核仁結(jié)構(gòu)改變，免疫熒光法檢測(cè)PTEN蛋白在內(nèi)源性沉默PICT-1及外源性核糖體應(yīng)激下的細(xì)胞內(nèi)分布改變。生長(zhǎng)曲線及細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PICT-1沉默后或外源性核糖體應(yīng)激下同時(shí)沉默PICT-1后細(xì)胞增殖生長(zhǎng)能力，并計(jì)數(shù)行定

12、量統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，流式細(xì)胞學(xué)用于細(xì)胞周期分析;劃痕實(shí)驗(yàn)用于PICT-1沉默后癌細(xì)胞侵襲性比較。
　　 結(jié)果:PICT-1沉默特異性高，其造成的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制效果可被鼠源PICT-1表達(dá)后所“挽救”。與sh GFP陰性對(duì)照比較，PICT-1沉默組:使B23蛋白彌散分布于細(xì)胞核，且核仁結(jié)構(gòu)完整性受到破壞;luciferase assay顯示P53信號(hào)通路被激活;P53及PTENmRNA無明顯變化;P53、MDM2、P21、磷酸化AKT蛋白

13、上調(diào)，PTEN及B23蛋白下調(diào);MDM2蛋白半衰期從0.5小時(shí)延長(zhǎng)為2小時(shí);與sh GFP陰性對(duì)照組比較，PICT-1沉默使細(xì)胞生長(zhǎng)減慢，集落形成能力下降(P＜0.05或P＜0.01)，細(xì)胞周期部分阻滯于G0/G1期;但劃痕實(shí)驗(yàn)顯示細(xì)胞的侵襲能力卻增強(qiáng);在外源性核糖體應(yīng)激作用下，沉默PICT-1后細(xì)胞生長(zhǎng)快于陰性對(duì)照(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 (1) PICT-1沉默破壞了核仁結(jié)構(gòu)，引起內(nèi)源性核