基于信號擴(kuò)增策略構(gòu)建的高靈敏熒光適體傳感器用于檢測腺苷.pdf

1、生物傳感器是將目標(biāo)物識別過程轉(zhuǎn)換成信號并有效輸出的一種快速檢測和監(jiān)控裝置，其在許多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，如藥物分析、生物技術(shù)、環(huán)境保護(hù)和臨床診斷等。適體的介入為傳感器的研究發(fā)展提供了新的動(dòng)力。由于其高特異性和高結(jié)合力的固有性質(zhì)，以適體為識別元素的傳感器成為近年來研究的熱點(diǎn)。到目前為止，多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的適體傳感器已經(jīng)被建立，其中，熒光適體傳感器因其儀器設(shè)備操作簡單、靈敏度高、選擇性好、響應(yīng)快速、且對樣品不會造成破壞等優(yōu)點(diǎn)，得到廣泛應(yīng)用。本文的

2、研究工作是利用生物化學(xué)分析的新技術(shù)構(gòu)建新型的熒光適體傳感器用于檢測目標(biāo)物。
　　腺苷是一種內(nèi)源性核苷，同時(shí)也是重要的藥物小分子，在生理和藥理方面發(fā)揮著重要作用，如舒張血管、控制平滑肌收縮等，是人體生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)者。其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)中均起著重要的作用。此外，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，腺苷還可作為癌癥的潛在標(biāo)志物。因此，腺苷的檢測對心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤的診斷和治療等方面都具有重要的意義[153

3、-159]。
　　目前，大量的腺苷適體傳感體系已被構(gòu)建用于腺苷的分析檢測，然而由于腺苷在正常人尿液和血清中含量極低，它們的靈敏度往往不夠理想，不能直接用于復(fù)雜生物樣本（人尿液和血清）中腺苷的定量檢測（據(jù)報(bào)道正常人尿樣中腺苷濃度范圍在2.0×10-6molL-1到7.0×10-6mol L-1之間，血清中腺苷濃度范圍在5.0×10-8mol L-1到1.0×10-7mol L-1之間）[176，178]。而生物樣本中腺苷的檢測在臨床

4、研究和疾病的診斷和預(yù)防方面具有較高的臨床應(yīng)用意義，例如生理?xiàng)l件下腺苷含量的波動(dòng)可用于心、腦生理功能的研究，尿液中腺苷含量的升高可用于腫瘤的早期診斷。因此，如何提高傳感器的靈敏度，并實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物樣本中低腺苷含量的檢測是目前腺苷檢測面臨的重要問題。本文利用高效的信號擴(kuò)增策略，構(gòu)建了新穎且通用的熒光適體傳感器，使腺苷的靈敏度有了很大提高，并可達(dá)到生物樣品中的定量檢測。
　　本文第一章為緒論部分，首先對生物傳感器進(jìn)行了概述，并著重介紹了熒

5、光適體傳感器的特點(diǎn)、優(yōu)勢和應(yīng)用前景;其次，對常用的信號擴(kuò)增策略進(jìn)行了概述;最后，介紹了腺苷檢測的意義、現(xiàn)有方法、腺苷適體傳感器及面臨問題。
　　本文第二章，利用外切酶Ⅲ輔助的DNA循環(huán)和雜交鏈反應(yīng)(HCR)的雙重放大作用，構(gòu)建了一種免標(biāo)記且靈敏的熒光適體傳感器用于檢測腺菅。在該方案中，首先設(shè)計(jì)了一個(gè)包含催化鏈、適體鏈和鏈霉親和素化磁球的三功能探針。當(dāng)目標(biāo)物被適體鏈識別之后，催化鏈會立即被釋放。然后，催化鏈觸發(fā)ExoⅢ輔助的DNA循

6、環(huán)，產(chǎn)生大量的DNA片段，從而獲得第一次放大。隨后，DNA片段作為觸發(fā)鏈引發(fā)HCR，形成帶有許多G-四分體結(jié)構(gòu)的雙螺旋，獲得了第二次放大。最終，熒光染料N-甲基卟啉二丙酸Ⅸ(NMM)插入到G-四分體結(jié)構(gòu)中，產(chǎn)生增強(qiáng)的熒光響應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了免標(biāo)記的檢測。該方法的檢測限為4.2×10-7molL-1。此外，該方法特異性良好，并且能夠區(qū)分癌癥病人和正常人尿樣中腺苷的含量，為腺苷的檢測提供了一種新的可靠的定量方法。
　　雖然上述構(gòu)建的適體傳感器

7、成功且靈敏的對腺苷進(jìn)行了檢測，但是，在實(shí)驗(yàn)過程中，為了獲得低背景信號，我們引入了磁球?qū)δ繕?biāo)物進(jìn)行富集和分離。然而，磁球的引入需要對其進(jìn)行修飾、活化和分離，這無疑增加了操作上的復(fù)雜性和實(shí)驗(yàn)的成本。為此，我們展開了下一個(gè)工作，也就是本文的第三章，利用聚合切刻循環(huán)反應(yīng)和發(fā)卡結(jié)構(gòu)催化自組裝（CHA）的雙重?cái)U(kuò)增機(jī)制，構(gòu)建了一種均相中檢測腺苷的新方法。該方法設(shè)計(jì)了一個(gè)含有腺苷適體、切刻酶識別位點(diǎn)和CHA觸發(fā)鏈互補(bǔ)堿基的發(fā)卡探針。當(dāng)目標(biāo)物存在時(shí)，適體

8、識別腺苷使得發(fā)卡探針構(gòu)象發(fā)生改變，在聚合酶、dNTPs和切刻酶的作用下，發(fā)生聚合切刻循環(huán)反應(yīng)，產(chǎn)生大量單鏈DNA;此步為第一次擴(kuò)增;然后，單鏈DNA作為CHA的引物鏈，觸發(fā)CHA生成大量帶有G-四分體的雙鏈DNA，此步為第二次擴(kuò)增;最終插入熒光染料NMM，實(shí)現(xiàn)熒光信號的免標(biāo)記檢測，檢測限達(dá)到1.3×10-7mol L-1。該檢測限比其他檢測腺苷的免標(biāo)記方法降低了兩個(gè)數(shù)量級[171，175]，較本課題組降低了約50倍[148]。該方法可實(shí)