mDRA-6與熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞協(xié)同作用的研究.pdf

1、背景:
　　 腫瘤熱療(hyperthermia)是繼手術(shù)、放療、化療之后一種全新的治療腫瘤的“綠色療法”，是腫瘤治療的有效手段之一，但是其作用機(jī)制長(zhǎng)期不甚明了，近年來(lái)，隨著熱療設(shè)備的不斷革新和技術(shù)的不斷進(jìn)步，熱療已成為研究的熱點(diǎn)。
　　 熱療于1985年獲美國(guó)食品及藥物管理局認(rèn)證，和手術(shù)、化療、放療、生物免疫治療一起成為腫瘤綜合治療的有效手段。我國(guó)衛(wèi)生部于2009年11月頒布了《腫瘤深部熱療和全身熱療技術(shù)管理規(guī)范(試行

2、)》。
　　 為探討DR5功能性抗體抗腫瘤作用以及TRAIL/DR5相互作用的分子機(jī)制，河南大學(xué)細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室利用DR5蛋白免疫BALB/c小鼠，制備出功能性抗DR5單克隆抗體，命名為mDRA-6。
　　 近年來(lái)，熱作用于腫瘤細(xì)胞后凋亡基因表達(dá)的研究，多集中在P53、HSP-70、c-Myc等，熱療后腫瘤細(xì)胞凋亡與DR5的關(guān)系未見(jiàn)報(bào)道；基于熱誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制的聯(lián)合治療方法，主要集中在熱療與化療藥物、放療等，熱療與

3、mDRA-6、熱療與mDRA-6+化療對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究采用肝癌常見(jiàn)的SMMC-7721細(xì)胞系，探討熱療對(duì)mDRA-6+熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的協(xié)同作用，mDRA-6+化療+熱療對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響，熱療導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制和熱療對(duì)細(xì)胞膜DR5表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的影響進(jìn)行了初步觀察。
　　 目的:
　　 探討熱療對(duì)SMMC-7721肝癌細(xì)胞的影響，從而探討熱療引起腫瘤細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制；探討

4、熱療和人抗DR5單克隆抗體致腫瘤細(xì)胞凋亡的協(xié)同作用。
　　 方法:
　　 將SMMC-7721肝癌細(xì)胞系，置恒溫循環(huán)水浴鍋中42.5℃±0.5℃孵育1h，然后放入37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，分別于熱處理后0、6、12、24h，采用倒置顯微鏡LM×400觀察細(xì)胞形態(tài)變化，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Annexin V/PI染色流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，抗DR5抗體366EC和FITC-羊抗鼠IgG處理細(xì)胞，流式細(xì)胞儀

5、檢測(cè)細(xì)胞DR5表達(dá)和Fluo-3/AM負(fù)載細(xì)胞檢測(cè)胞內(nèi)Ca2+濃度(平均熒光強(qiáng)度，MFI)的變化。
　　 MTT法檢測(cè)抗人DR5單克隆抗體單獨(dú)或聯(lián)合應(yīng)用順鉑或熱療對(duì)肝癌SMMC-7721細(xì)胞體外增殖的抑制作用；流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同藥物對(duì)SMMC-7721細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果:
　　 熱療可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形態(tài)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞變小、變圓、脫落、出現(xiàn)空泡；熱療可抑制細(xì)胞增殖，細(xì)胞熱療1h后0h、6h、12h、24h

6、細(xì)胞抑制率分別為：22.18％，26.76％，31.30％，36.62％。細(xì)胞凋亡率：細(xì)胞熱療1h后0h、6h、12h、24h Annexin V/PI雙染，熱療后0h細(xì)胞凋亡率為15％，其中早期凋亡率為2％，晚期凋亡率為13％；熱療后6h細(xì)胞凋亡率為65.45％，其中早期凋亡率為43.23％，晚期凋亡率為22.22％；熱療后12h，細(xì)胞凋亡率為12.32％，其中早期凋亡率為4.6％，晚期凋亡率為7.72％；熱療后24h細(xì)胞凋亡率為22

7、.58％，其中早期凋亡率為7.15％，晚期凋亡率為15.43％。細(xì)胞熱療1h后0h、4h、8h、12h、24h細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度(平均熒光強(qiáng)度，MFI)分別為：18.13±0.20、13.44±0.84、7.87±3.35、13.01±2.38、37.24±1.31，對(duì)照組為14.28±3.65。細(xì)胞熱療1h后0h、6h、12h、24h細(xì)胞膜DR5表達(dá)率分別為：79.74％、83.22％、91.28％、92.52％，對(duì)照組為83.02％。

8、
　　 未經(jīng)熱處理細(xì)胞增殖抑制率分別為：順鉑組32％；m-DRA-6組22％；順鉑與m-DRA-6聯(lián)合組37％。熱處理細(xì)胞增殖抑制率分別為：順鉑組58.06％；m-DRA-6組14.52％；順鉑與m-DRA-6聯(lián)合組91.13％。細(xì)胞凋亡：未經(jīng)熱處理：順鉑組13.53％；m-DRA-6組13.66％；順鉑與m-DRA-6聯(lián)合組84.24％。熱處理組：對(duì)照組9.41％，順鉑組30.27％％，m-DRA-6組57.52％，順鉑與m-

9、DRA-6聯(lián)合組91.33％。
　　 結(jié)論:
　　 療可提高肝癌SMMC-7721細(xì)胞膜DR5的表達(dá)，可提高肝癌SMMC-7721細(xì)胞內(nèi)Ca2+；腫瘤細(xì)胞凋亡與細(xì)胞膜DR5的高表達(dá)、細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加有關(guān)；細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加可能是熱療致腫瘤細(xì)胞晚期凋亡的主要原因?？谷薉R5單克隆抗體可增加化療藥物抗腫瘤作用，熱療與抗人DR5單克隆抗體和化療藥物有協(xié)同作用；熱療不僅可顯著增加腫瘤細(xì)胞凋亡，還可增加抗人DR5單克隆抗體和