不同抗原負(fù)載人樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)特異性抗宮頸癌效應(yīng)的實驗研究.pdf

1、宮頸癌是發(fā)展中國家最常見的婦科惡性腫瘤。大量研究表明宮頸細(xì)胞學(xué)篩查有效降低了宮頸癌的發(fā)生率和死亡率。但是，發(fā)展中國家由于缺乏組織良好的普查計劃，宮頸癌仍是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的第二大原因。目前認(rèn)為HPV感染是宮頸癌發(fā)生的始動因素。流行病學(xué)調(diào)查和分子生物學(xué)研究表明，宮頸癌發(fā)生與高危型人乳頭狀瘤病毒(如HPV 16，HPV-18，HPV-31等)感染密切相關(guān)，在99.7％以上的-宮頸癌及其前體病變(鱗狀上皮內(nèi)瘤變)中存在HPV DNA，并以HP

2、V 16最為常見，占50％。因此，HPV16己成為宮頸癌疫苗的主要靶標(biāo)。 除了感染因素，免疫抑制是宮頸癌發(fā)展的另一個重要因素。研究表明，在腎移植、HIV感染等免疫抑制的婦女，宮頸癌的危險性明顯升高。近年來，以免疫治療和基因治療為代表的生物治療作為腫瘤治療的第四種模式日益受到重視，作為宮頸癌治療的重要輔助手段之一，生物治療已逐漸顯示出其獨特的優(yōu)越性。 腫瘤的細(xì)胞免疫主要是T細(xì)胞免疫，依賴于有效的抗原遞呈。樹突狀細(xì)胞是體

3、內(nèi)唯一能夠激活初始型T細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞，是啟動、調(diào)控并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)，因此利用DC在患者體內(nèi)建立起腫瘤特異的、持久的免疫應(yīng)答，是目前將DC腫瘤疫苗用于治療惡性腫瘤的基礎(chǔ)，也是一種有應(yīng)用前景的腫瘤免疫治療的新方法。 嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷鼠--SCID鼠同時缺乏T細(xì)胞和B細(xì)胞，可以用人類免疫細(xì)胞進行免疫功能重建，適合于在動物體內(nèi)研究人類免疫細(xì)胞和人類腫瘤的關(guān)系，是理想的腫瘤及免疫功能重建的動物模型，為進一步研究HPV16陽性

4、的宮頸癌免疫治療尤其是DC疫苗研究提供有價值的動物模型。 由此我們設(shè)想如果通過樹突狀細(xì)胞攝取HPVl6相關(guān)抗原，那么由它誘導(dǎo)的CTL是否可對HPVl6陽性的宮頸癌細(xì)胞產(chǎn)生特異性的殺傷活性。因此本實驗首先探討DC在抗腫瘤免疫中發(fā)揮作用，除了依靠其抗原遞呈功能外，是否本身也可作為效應(yīng)細(xì)胞來直接殺傷或抑制腫瘤的生長，然后設(shè)計了不同形式的抗原負(fù)載DC，觀察其誘導(dǎo)的CTL體外抗宮頸癌免疫效應(yīng)，并在免疫重建荷人宮頸癌CaSki細(xì)胞重癥聯(lián)合免

5、疫缺陷(SCID)鼠動物模型中觀察負(fù)載HPV16E7多肽的樹突狀細(xì)胞疫苗對移植瘤的影響。 第一部分 人外周血及臍血來源樹突狀細(xì)胞 對宮頸癌細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng) 目的：探討人外周血及臍血來源樹突狀細(xì)胞(DC)的生物學(xué)特性及其對宮頸癌細(xì)胞的直接殺傷效應(yīng)。 方法：自外周血及臍血分離獲得單核細(xì)胞，體外經(jīng)人重組細(xì)胞因子rhGM—CSF、rhIL—4和rhTNF—α誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得DC，觀察細(xì)胞形態(tài)，采用流式細(xì)胞儀(FCM

6、)檢測DC相關(guān)表型；MTT法檢測人外周血及臍血來源DC對宮頸癌細(xì)胞Hela及CaSki的體外直接殺傷效應(yīng)。 結(jié)果：人外周血及臍血來源單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)第6天后具有典型DC形態(tài)，F(xiàn)CM結(jié)果顯示高表達HLA-DR(分別為99.29％和98.14％)、CD86(分別為99.45％和90.92％)和CD209(分別為87.44％和83.14％)，而CDl4表達率較低(分別為0％和3.32％)；抑瘤實驗顯示人外周血及臍血來源DC在效靶比20

7、:1、10:1和5:l時，對宮頸癌細(xì)胞Hela及CaSki均有明顯殺傷效應(yīng)(10％以上)，最高可達39.97％。 結(jié)論：人外周血及臍血來源DC對人宮頸癌細(xì)胞具有直接殺傷效應(yīng)，兩者具有相似的生物學(xué)特性，本結(jié)論為DC在腫瘤免疫治療中的作用提供了新思路。 第二部分 目的：研究負(fù)載不同抗原的樹突狀細(xì)胞(DC)誘導(dǎo)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)體外殺傷宮頸癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效應(yīng)。 方法：制備重組HPVl6E7蛋白、合

8、成HPVl6E7<'49-57>多肽和含有CpG基序的寡脫氧核苷酸(CpG-ODN)作為不同的抗原，自人外周血和臍血單核細(xì)胞誘導(dǎo)DC，負(fù)載不同的抗原。ELISA法檢測各組成熟DC上清中IL-12的含量，混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測定各組DC體外刺激T細(xì)胞增殖的能力，MTT法檢測負(fù)載不同抗原的DC激活的CTL對宮頸癌細(xì)胞系CaSki和HeLa的殺傷作用。 結(jié)果：與未經(jīng)抗原負(fù)載的DC相比，抗原負(fù)載的各組DC刺激同種異體T細(xì)胞增殖和I

9、L-12分泌的能力均有提高，激活的CTL對CaSki細(xì)胞有特異性殺傷，以HPVl6E7<'49-57>多肽聯(lián)合CpG-ODN組效果明顯，而此類CTL對HeLa細(xì)胞無特異性殺傷效應(yīng)。 結(jié)論：HPV16E7<'49-57>多肽聯(lián)合CpG-ODN負(fù)載DC體外可誘導(dǎo)特異性殺傷宮頸癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)。 第三部分 負(fù)載HPVl 6E7多肽的樹突狀細(xì)胞疫苗對免疫重建荷人宮頸癌SCID鼠免疫治療作用的實驗研究 目的：觀察負(fù)載H

10、PVl6E7多肽的樹突狀細(xì)胞疫苗對免疫重建荷人宮頸癌CaSki細(xì)胞重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)鼠移植瘤的影響。 方法：對SCID鼠腹腔注射人外周血單個核細(xì)胞后24小時，皮下接種HPVl6陽性的人宮頸癌細(xì)胞株CaSki細(xì)胞，建立人免疫重建荷CaSki細(xì)胞的SCID鼠模型。荷瘤一周后，腹腔接種疫苗，一周后強化一次，觀察荷瘤鼠一般生物學(xué)特性，檢測血中人IgG含量、人CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞、IFN-Y水平，

11、抑瘤率及生存期觀察。依據(jù)注射疫苗的不同，實驗分為4組：空白組(NS組)，腹腔注射生理鹽水；DC組，腹腔注射不攝取抗原的DC；P組，腹腔注射已攝取HPVl6E7<'49-57>多肽抗原的DC；P+O組，腹腔注射同時攝取HPVl 6E7<'49-57>多肽抗原和CpGODN2006的DC。 結(jié)果：免疫重建的小鼠成瘤率為100％，荷瘤潛伏期為7～10天。各組SCID鼠血中均可檢測到人IgG的存在，并隨重建時間的延長而升高。各組均檢測到人

12、CD3<'+>、CD4<'+>、CD8<'+>T細(xì)胞，但組間無顯著差異(P>0.05)。移植瘤局部均可見明顯的TIL浸潤和壞死現(xiàn)象。與NS組比較，DC組、P組、P+O組均有抑制腫瘤生長、促進IFN-Y產(chǎn)生及延長生存期的作用，以P+O組更為明顯。 結(jié)論：用HPV16陽性CaSki細(xì)胞皮下接種和人外周血淋巴細(xì)胞腹腔注射于SCID鼠，可成功建立人免疫重建荷人宮頸癌SCID鼠模型。此模型能較好地模擬人自發(fā)宮頸癌的生物學(xué)特征。在免疫重建