連作土壤寄生真菌多樣性及對(duì)大豆胞囊線蟲抑制作用.pdf

1、大豆胞囊線蟲（Heterodera glycines，Ichinohe）病是大豆生產(chǎn)中的重要限制因子之一，其病原大豆胞囊線蟲是一種典型定居型內(nèi)寄生土傳線蟲，大豆連作會(huì)使土壤中大豆胞囊線蟲不斷積累，導(dǎo)致病害加重，因此大豆胞囊線蟲也是引起大豆連作障礙的主要因素之一。然而，當(dāng)大豆感病品種連續(xù)種植5年以上，會(huì)出現(xiàn)大豆胞囊線蟲自然衰退現(xiàn)象，并將存在這種現(xiàn)象的土壤稱為大豆胞囊線蟲抑制性土壤。抑制性土壤中寄生微生物-大豆胞囊線蟲-大豆三者之間形成一種

2、特殊的環(huán)境抑制生態(tài)系統(tǒng)。大豆胞囊線蟲寄生真菌作為抑制性土壤中的抑制因子之一，在該抑制生態(tài)系統(tǒng)中作用至關(guān)重要。為了探討抑制性土壤中大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌多樣性及其作用，以大豆長(zhǎng)期定位輪作體系為研究對(duì)象，采用大豆胞囊線蟲寄生真菌傳統(tǒng)分離方法，利用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并結(jié)合Biolog微平板分析技術(shù)和變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法，研究大豆長(zhǎng)期連作（23年）、大豆2年連作（玉米-大豆-大豆，8個(gè)循環(huán)周期）和長(zhǎng)期輪作（小麥-玉米-大豆，

3、8個(gè)輪作周期）下大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群特征、優(yōu)勢(shì)寄生真菌種類多樣性及對(duì)大豆胞囊線蟲致病作用。通過解析大豆胞囊線蟲抑制性土壤中大豆胞囊線蟲寄生真菌種群結(jié)構(gòu)特征和明確大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生真菌作用，進(jìn)一步揭示了大豆胞囊線蟲抑制性土壤衰退機(jī)制，對(duì)抑制性土壤抑制生態(tài)系統(tǒng)和線蟲生態(tài)研究具有重要的價(jià)值和意義。
　　通過對(duì)大豆長(zhǎng)期定位輪作體系下大豆胞囊線蟲種群密度和大豆生長(zhǎng)情況調(diào)查，結(jié)果顯示，大豆經(jīng)過23年連作以后，大豆胞囊線蟲種群密度下降

4、，盛花期和鼓粒盛期表現(xiàn)尤為明顯。在大豆盛花期和鼓粒盛期土壤中飽滿胞囊密度每100g土中均僅含有7個(gè)，顯著低于大豆2年連作(P＜0.05)，與輪作差異不顯著。大豆23年連作下，土壤中大豆胞囊線蟲空胞囊占總胞囊數(shù)量比率顯著升高，在大豆盛花期和鼓粒盛期，空胞囊比率可達(dá)到70％，顯著高于大豆2年連作。在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中，大豆胞囊線蟲種群密度變化特征存在差異。大豆2年連作和輪作下，在大豆生育期進(jìn)程中大豆胞囊線蟲種群密度呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而大豆23

5、年連作下，大豆胞囊線蟲種群密度變化不明顯，且在大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊線蟲種群密度有下降趨勢(shì)。此外，大豆23年連作下，由于大豆胞囊線蟲種群密度下降，大豆生長(zhǎng)狀況明顯改善，大豆產(chǎn)量較大豆2年連作明顯升高。說明大豆經(jīng)過長(zhǎng)期連作以后形成抑制性土壤，控制大豆胞囊線蟲種群密度，改善由于連作障礙引起的大豆生長(zhǎng)不良和產(chǎn)量降低現(xiàn)象，且在盛花期和鼓粒盛期對(duì)大豆胞囊線蟲種群密度抑制作用尤為明顯。
　　采用Biolog微平板方法對(duì)大豆23年連作、大

6、豆2年連作和輪作方式下大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物功能多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中，大豆2年連作下，大豆胞囊線蟲寄生微生物碳源利用能力有增加趨勢(shì)，且對(duì)碳源的利用程度較為均勻。大豆23年連作除播前期外，在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中與輪作結(jié)果相似，微生物活性和功能多樣性均沒有明顯變化，但是大豆23年連作下大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物對(duì)碳源的利用程度差異較大。冗余分析結(jié)果表明，3種輪作方式下，大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物主要利用的碳源

7、類型存在差異。主成分分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中，大豆23年連作、輪作和大豆2年連作下大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物對(duì)碳源的利用能力明顯分成3組，而主要引起這種差異的碳源類型為糖類、氨基酸類、羧酸類和多聚物類。說明大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物功能多樣性與大豆胞囊線蟲種群密度呈正相關(guān)，且大豆經(jīng)過23年連作以后大豆胞囊線蟲胞囊寄生微生物種群發(fā)生改變，有優(yōu)勢(shì)微生物存在。
　　通過變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法對(duì)不同輪作體系下大豆胞囊

8、線蟲胞囊寄生真菌種群多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中，大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群結(jié)構(gòu)存在變化，不同輪作體系之間條帶亮度和數(shù)量存在差異，大豆23年連作下存在特異性條帶，在大豆整個(gè)生育期進(jìn)程中，大豆23年連作和輪作下隨著大豆生育期的推進(jìn)，大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群多樣性存在增加趨勢(shì)，且胞囊寄生真菌多樣性明顯高于大豆2年連作。對(duì)DGGE圖譜中具有代表性20條特異性條帶進(jìn)行DNA序列切膠測(cè)序，結(jié)果表明，這些大豆胞囊線蟲寄生真

9、菌種群主要分布于子囊菌門(Ascomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)。主成分分析結(jié)果表明，在大豆生育期進(jìn)程中3種輪作方式下，大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群明顯分開，大豆經(jīng)過長(zhǎng)期連作以后，大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌Aeremonium sclerotigenum、Paraphomaradicina、Mortierella elongata、Verticillium chlamy

10、dosporium和口Galactomyces candidum為大豆23年連作下優(yōu)勢(shì)大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌，大豆2年連作下優(yōu)勢(shì)大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌包括:Paraphoma chrysanthemicola、Cylindrocarpon sp.、Neonectria ramulariae、Fusarium oxysporum和Galactomyces candidum。說明大豆經(jīng)過長(zhǎng)期連作以后，土壤中大豆胞囊線蟲胞囊寄生真菌種群結(jié)

11、構(gòu)發(fā)生明顯改變，并形成特有的大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)胞囊寄生真菌。
　　采用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定不同輪作體系下大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)和特殊寄生真菌。結(jié)果表明，不同輪作體系下大豆胞囊線蟲寄生真菌主要包括:尖孢鐮孢菌（Fusarium oxysporum）、厚垣輪枝菌（Verticillium chlamydosporium）、互隔交鏈孢霉（Alternaria alternate）、根異莖點(diǎn)霉（Paraphoma radicin

12、a）、Neonectria radicicola、鏈蠕孢屬（Dendryphion nanum）、輪狀鐮孢菌（Fusarium verticillioides）、短梗蠕孢菌（Trichocladium opacum）、長(zhǎng)被孢霉（Mortierella elongata）、淡紫擬青霉（Paecilomyceslilacinus）、青霉（Penicillium polonicum）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、花斑

13、曲霉（Aspergillus versicolor）和黑曲霉(Aspergillus niger)。這些大豆胞囊線蟲寄生真菌很可能是對(duì)大豆胞囊線蟲具有潛力的生防真菌。
　　利用傳統(tǒng)大豆胞囊線蟲寄生真菌分離方法，對(duì)不同輪作體系下大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生真菌分離，結(jié)果表明在大豆23年連作下，大豆整個(gè)生育期內(nèi)，從大豆胞囊線蟲不同蟲態(tài)上均分離到了大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生真菌鐮孢菌（Fusarium spp.）、厚垣輪枝菌（Verticillium

14、chlamydosporium）和淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus），且數(shù)量明顯高于大豆2年連作和輪作。其中23年連作下，大豆盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊線蟲卵寄生真菌分離頻率為1.3％和2.6％，而大豆2年連作下盛花期未分離到大豆胞囊線蟲卵寄生真菌，鼓粒盛期大豆胞囊線蟲卵寄生真菌分離頻率僅為0.1％。輪作盛花期和鼓粒盛期大豆胞囊線蟲卵寄生真菌分離頻率也僅為0.4％和0.8％。大豆23年連作下，在大豆盛花期和鼓粒盛期

15、優(yōu)勢(shì)寄生真菌分離數(shù)量出現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)。同時(shí)，大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生真菌與大豆胞囊線蟲種群密度呈現(xiàn)一定負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，說明大豆胞囊線蟲寄生真菌很可能與抑制性土壤中大豆胞囊線蟲種群密度自然衰退有關(guān)。
　　對(duì)抑制性土壤中大豆胞囊線蟲優(yōu)勢(shì)寄生真菌鐮孢菌（Fusarium spp.）、厚垣輪枝菌（Verticillium chlamydosporium）和淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）不同菌株寄生不同蟲態(tài)大豆胞囊線蟲致

16、病性測(cè)定研究結(jié)果顯示，不同種寄生真菌和同種寄生真菌不同菌株之間對(duì)大豆胞囊線蟲的抑制效果均存在差異。其中鐮孢菌H-4-E-14、G-4-E-16和4-G-C-A菌株對(duì)大豆胞囊線蟲抑制作用均達(dá)到90％以上，H-4-E-14菌株對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊孵化的抑制率最高可達(dá)97.1％，菌株G-4-E-16對(duì)大豆胞囊線蟲卵孵化的抑制率較高為90.6％，4-G-C-A菌株對(duì)大豆胞囊線蟲J2抑制作用最佳，可達(dá)到95.3％。厚垣輪枝菌菌株4-H-C-12對(duì)大

17、豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制作用最好達(dá)到95.2％，而菌株4-G-C-6對(duì)大豆胞囊線蟲卵孵化的抑制率最高為81.6％，4-H-C-12菌株對(duì)大豆胞囊線蟲J2抑制作用也較好達(dá)到96％。淡紫擬青霉17-H-C-15菌株對(duì)大豆胞囊線蟲胞囊孵化的抑制率最好達(dá)到96.8％，而菌株4-G-C-10對(duì)大豆胞囊線蟲卵孵化的抑制效果最好，該菌株對(duì)大豆胞囊線蟲J2抑制作用也較強(qiáng)可達(dá)到92％。說明這些大豆胞囊線蟲寄生真菌均可通過寄生作用抑制大豆胞囊線蟲胞囊和卵孵化