核CaMⅠ-CaMKⅡ-CaMKIV信號通路在大鼠肥厚心肌中的意義及對β-MHC與c-fos基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的研究.pdf

1、心肌肥厚是心肌對多種刺激的適應(yīng)性反應(yīng)，但長期的心肌肥厚公認是發(fā)生多種心血管并發(fā)癥的獨立危險因素。心肌細胞鈣穩(wěn)態(tài)失衡是心肌肥厚的重要機制之一，近年研究提示：心肌細胞核存在相對獨立的鈣調(diào)節(jié)系統(tǒng)，心肌細胞核鈣感受蛋白改變并引起靶基因異常轉(zhuǎn)錄可能是心肌肥厚的機制之一。本課題首先制備大鼠腹主動脈縮窄心肌肥厚模型，提純完整且具有活性的心肌細胞核。觀察肥厚心肌的細胞核和細胞漿CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ及CREB、pCREB的蛋白變化，CaMKⅡ

2、、CaMKⅣ的活性變化。檢測肥厚心肌中α-MHC、β-MHC、c-fosmRNA的變化，并觀察拮抗心肌細胞核的外核膜Ca++-ATP酶，抑制細胞核對鈣的主動攝??；拮抗內(nèi)核膜RyR、IP3受體，抑制心肌細胞核膜鈣庫中的鈣向核內(nèi)釋放；使用CaMⅠ的拮抗劑、CaMⅠ調(diào)節(jié)酶拮抗劑、CaMKⅡ拮抗劑，在不同位點抑制核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ的信號傳導(dǎo)后β-MHC、c-fos基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化。 通過探討核CaMⅠ/CaMKⅡ-C

3、aMKⅣ信號通路在肥厚心肌中的變化及對β-MHC、c-fos基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，進一步闡明心肌肥厚的發(fā)生機制。 方法： 1.健康雄性SD大鼠150只，隨機分為手術(shù)組和對照組，采用腹主動脈縮窄法建立心肌肥厚模型。 2.用差速離心和密度梯度離心法提純細胞核，酶學(xué)方法鑒定細胞核純度，以Follin酚法行蛋白質(zhì)定量，二苯胺法行DNA定量。 3.免疫組化方法觀察左室心肌組織鈣感受蛋白CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ

4、及核轉(zhuǎn)錄因子CREB、pCREB的分布。 4.免疫蛋白印跡法觀察肥厚心肌的細胞核及細胞漿CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ及CREB、pCREB的蛋白含量變化。 5.同位素32P摻入法檢測肥厚心肌的細胞核及細胞漿CaMKⅡ和CaMKⅣ的活性變化。 6.RT-PCR法檢測肥厚心肌α-MHC、β-MHC、c-fosmRNA的變化。 7.延續(xù)轉(zhuǎn)錄分析法在離體心肌細胞核上觀察拮抗心肌細胞核的外核膜Ca++-ATP酶

5、，抑制細胞核對鈣的主動攝取；拮抗內(nèi)核膜RyR、IP3受體，抑制心肌細胞核膜鈣庫中的鈣向核內(nèi)釋放；使用CaMⅠ的拮抗劑、CaMⅠ調(diào)節(jié)酶拮抗劑、CaMKⅡ拮抗劑，在不同位點抑制核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ的信號傳導(dǎo)后β-MHC、c-fos基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化。 結(jié)果： 一、大鼠腹主動脈縮窄心肌肥厚模型的建立及心肌細胞核的提純 1.大鼠腹主動脈縮窄心肌肥厚模型的建立及評價：大鼠腹主動脈縮窄術(shù)后4周左心室重量指數(shù)較

6、對照組明顯增加(P＜0.05)，平均頸總動脈壓、頸總動脈收縮壓、頸總動脈舒張壓、左心室收縮末壓較對照組明顯增加(P＜0.01)。 2.心肌細胞核的提純：提純的心肌細胞核純度采用酶學(xué)方法鑒定，其它細胞器標志酶均小于5％，蛋白質(zhì)約為DNA的6～7倍。電鏡觀察見細胞核形態(tài)呈橢圓形，核膜完整，核仁清晰。 二、核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ信號通路及CREB磷酸化在肥厚心肌的變化 1.心肌細胞CaMⅠ、CaMKⅡ、Ca

7、MKⅣ的亞細胞定位：對照組左室心肌組織CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ蛋白呈弱陽性表達，CaMⅠ、CaMKⅡ陽性反應(yīng)產(chǎn)物分布在細胞核及細胞漿，CaMKⅣ陽性反應(yīng)產(chǎn)物僅分布在細胞核。心肌肥厚組左室心肌組織上述蛋白陽性著色較對照組明顯升高(P＜001)。 2.CaMⅠ、CaMKⅡ、CaMKⅣ蛋白在肥厚心肌中的變化：心肌肥厚組大鼠心肌細胞核及細胞漿CaMⅠ、CaMKⅡ蛋白含量較對照組明顯升高(P＜0.01)，心肌細胞核CaMKⅣ蛋白含

8、量較對照組明顯升高(P＜0.01)。 3.CaMKⅡ、CaMKⅣ活性在肥厚心肌中的變化：與對照組比較，心肌肥厚組心肌細胞核及細胞漿CaMKⅡ活性明顯增加(P＜0.01)，心肌細胞核CaMKⅣ活性明顯增加(P＜0.01)。 4.心肌細胞CREB、pCREB的亞細胞定位：免疫組化法觀察到CREB和pCREB免疫反應(yīng)陽性顆粒僅分布于細胞核，細胞漿未見陽性反應(yīng)。 5.CREB、pCREB蛋白在肥厚心肌中的變化：與對照組比

9、較，心肌肥厚組pCREB蛋白表達明顯升高(P＜0.01)，CREB蛋白表達無明顯差異(P＞0.05)。 三、核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ信號通路對β-MHC及c-fos基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控： 1.β-MHC和c-fos基因在肥厚心肌的變化：對照組左室心肌有少量β-MHCmRNA、c-fosmRNA表達，而α-MHCmRNA含量較高。心肌肥厚組左室心肌β-MHCmRNA、c-fosmRNA明顯高于對照組，而α-MHCmRN

10、A表達較對照組明顯下降(P＜0.01)。 2.調(diào)控核Ca++轉(zhuǎn)運對β-MHC、c-fos基因轉(zhuǎn)錄的影響：Ca++-ATP酶的拮抗劑毒胡蘿卜素(thapsigargin)、快鈣鏊合劑BAPTA明顯抑制肥厚心肌的β-MHCmRNA(分別降低66％、60％，P＜0.01)及c-fosmRNA轉(zhuǎn)錄(分別降低71％、68％，P＜0.01)：RyR拮抗劑rutheniumred，IP3受體拮抗劑heparin能抑制肥厚心肌的β-MHCmRN

11、A(分別降低28％、68％，P＜0.01)及c-fosmRNA轉(zhuǎn)錄(分別降低20％、72％，P＜0.01)。 3.調(diào)控核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ信號通路對β-MHC、c-fos基因轉(zhuǎn)錄的影響：CaMⅠ拮抗劑trifluoperazne、CaMⅠ調(diào)節(jié)酶拮抗劑calmidazoliumchloride、CaMKⅡ拮抗劑KN-62明顯抑制肥厚心肌的β-MHCmRNA(分別降低52％、43％、36％，P＜0.01)及c-fosm

12、RNA轉(zhuǎn)錄(分別降低63％、49％、36％，P＜0.01)。 結(jié)論： 1.成功制備了大鼠腹主動脈縮窄心肌肥厚模型，CaMⅠ、CaMKⅡ分布于心肌細胞漿及細胞核，而CaMKⅣ僅分布于心肌細胞核。肥厚心肌細胞核CaMⅠ和CaMKⅡ、CaMKⅣ的蛋白數(shù)量增加，CaMKⅡ和CaMKⅣ的活性明顯增強，表明核CaMⅠ/CaMKⅡ-CaMKⅣ信號通路在大鼠肥厚心肌中激活。 2.肥厚心肌pCREB蛋白含量較正常心肌明顯增加，而C

13、REB蛋白與正常心肌比較無明顯改變，說明肥厚心肌CREB磷酸化增加。提示pCREB可能通過磷酸化與脫磷酸化的方式參與其下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。 3.拮抗心肌細胞核的外核膜Ca-ATP酶，抑制細胞核對鈣的主動攝??；或拮抗內(nèi)核膜RyR、IP3受體，抑制心肌細胞核膜鈣庫中的鈣向核內(nèi)釋放，可以降低細胞核內(nèi)鈣濃度，明顯下調(diào)肥厚心肌β-MHC及c-fos基因的轉(zhuǎn)錄。 4.分別用CaMⅠ的拮抗劑、CaMⅠ調(diào)節(jié)酶拮抗劑、CaMKⅡ拮抗劑與細