DADS誘導(dǎo)HL-60細胞G2-M期阻滯差異表達基因的分離與克隆.pdf

1、研究目的:DADS(Diallyl disulfide,DADS)是從大蒜中分離出的一種脂溶性單體有機硫化合物,可通過抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡和細胞周期停滯等方式抑制多種腫瘤細胞的生長。DADS能誘導(dǎo)HL-60細胞的分化和凋亡,導(dǎo)致HL-60細胞增殖周期阻滯在G2/M期。本試驗分別用經(jīng)DADS處理、無DADS處理的人白血病HL-60細胞的mRNA做為tester、driver,構(gòu)建DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞G2/M期阻滯差異表

2、達文庫,試圖從中分離出與G2/M期阻滯相關(guān)基因。用RACE克隆來源于DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞G2/M期阻滯差異表達文庫的新EST的3、5端未知序列,為進一步研究其結(jié)構(gòu)和功能打下基礎(chǔ)。
　　方法:分別以DADS處理的HL-60細胞和未處理的人白血病HL-60細胞的mRNA做為tester和driver,用SSH構(gòu)建DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞G2/M期阻滯差異表達cDNA文庫。隨機挑選正向陽性克隆,PCR檢測插入片段

3、,將含插入片段的克隆測序。Blastn分析差異cDNA片段的同源性。
　　用RT-PCR驗證WT-1047在有無DADS處理時人白血病HL-60細胞中表達的差異性。獲得的ESTs依據(jù)其高度保守序列設(shè)計用于擴增的寡聚核苷酸引物,用設(shè)計的3引物和RACE試劑盒提供的5共用引物,進行3cDNA末端快速擴增,擴增產(chǎn)物克隆入pGEM-T Easy載體中,陽性克隆測序分析后,所得EST片段進行生物信息學(xué)分析。
　　結(jié)果:構(gòu)建了DADS誘

4、導(dǎo)人白血病HL-60細胞G2/M期阻滯差異表達cDNA文庫,其中包含120個正向的陽性克隆和100個反向的陽性克隆。51個隨機正向陽性克隆測序、比較同源性,發(fā)現(xiàn)7個新的EST片段,已經(jīng)在GenBank中登錄。其中WT-1047僅在DADS處理人白血病HL-60細胞中有表達;采用3RACE克隆出WT-1047的3端一段序列。
　　結(jié)論:構(gòu)建了DADS誘導(dǎo)人白血病HL-60細胞G2/M期阻滯差異表達cDNA文庫,該文庫含有120個正向