Her-2串聯(lián)表位蛋白免疫原性及特異性的研究.pdf

1、目的:
　　[1]根據(jù)本室已完成的預(yù)測(cè)信息，篩選三個(gè)富含T細(xì)胞和B細(xì)胞的Her-2/neu表位，構(gòu)建以pET21a-HBcAg(MIR)為載體的多表位串聯(lián)重組質(zhì)粒（含六個(gè)組氨酸標(biāo)簽-His.tag），并在原核系統(tǒng)進(jìn)行重組蛋白的表達(dá)和鑒定;
　　[2]對(duì)pET21a-HBcAg(MIR)-Her-2多表位串聯(lián)蛋白的免疫原性進(jìn)行研究，包括細(xì)胞免疫和體液免疫，并對(duì)MIR-Her-2/neu-Epi1和MIR-Her-2-Epi1/

2、Epi2/Epi3兩個(gè)重組蛋白的免疫原性差異性進(jìn)行分析;
　　[3]合成第三個(gè)表位肽，檢測(cè)乳腺癌病人抗-Her-2/neu自身抗體水平，對(duì)篩選的三個(gè)表位的免疫特異性進(jìn)行研究。
　　方法：
　　[1] PCR擴(kuò)增出Her-2/neu表位基因，連接到載體Pet21a-HBc(MIR)上構(gòu)建重組質(zhì)粒Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1、Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3，質(zhì)粒構(gòu)建成功后，

3、送測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果正確的兩個(gè)重組質(zhì)粒及載體pET21a/HBc轉(zhuǎn)化入表達(dá)載體EcoiBL21菌株中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE、Wb鑒定，處理包涵體，經(jīng)Ni-NTA親和層析法純化，并對(duì)純化蛋白進(jìn)行復(fù)性;
　　[2]選取6～8周齡的BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分為4組，每組6只。4個(gè)組別分別為PBS、載體蛋白Pet21a-HBc(MIR)、重組蛋白Pet21a/HBcAg(MIR)-Epi1和重組蛋白Pet21a/HBcAg(

4、MIR)-Epi1/Epi2/Epi3組，其中，PBS和載體蛋白Pet21a-HBc(MIR)組為陰性對(duì)照。用各重組蛋白于1、3、5w背部皮下多點(diǎn)注射免疫各對(duì)應(yīng)組小鼠，共免疫3次，PBS組注射等量PBS。免疫前一周即0w開始，行小鼠斷尾取血，后隔周一次，一共采集5次。酶聯(lián)免疫吸附(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)血清Her-2/neu特異性IgG;末次采血后，即免疫第8周，無菌取小鼠脾細(xì)

5、胞，用Her-2/neu CTL合成肽(Epi1上的一段9個(gè)氨基酸短肽，序列為KIFGSLAFL)刺激，P815細(xì)胞（小鼠肥大細(xì)胞）作為靶細(xì)胞，設(shè)置40∶1、20∶1、10∶1三個(gè)不同的效靶比，用LDH法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞的CTL殺傷活性;
　　[3]收集乳腺癌病人、乳腺纖維腺瘤和乳腺囊腫和正常人血清標(biāo)本。合成三Her-2/neu表位肽，并將這三個(gè)表位肽作為包被抗原，再采用ELISA方法檢測(cè)各組血清標(biāo)本抗-Her-2/neu特異性Ig

6、G抗體水平。
　　結(jié)果：
　　[1]成功構(gòu)建了Her-2/neu串聯(lián)表位重組質(zhì)粒pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3。經(jīng)SDS-PAGE和WB分析，重組蛋白pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1、pET21a/HBcAg(MIR)-Epi1/Epi2/Epi3及載體蛋白pET21a/HBcAg(MIR)均在原核系統(tǒng)內(nèi)得到了高效表達(dá)，Ni-NTA親

7、和層析法得到了條帶單一的純化蛋白;
　　[2]免疫原性檢測(cè)
　　體液免疫:ELISA結(jié)果顯示:Her-2/neu重組蛋白免疫能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的的Her-2特異性IgG，隨著免疫次數(shù)的增加抗體水平持續(xù)上升，至第六6周達(dá)到高峰。第6周時(shí)，單因素方差分析比較各組間IgG抗體水平差異，組間(F=317.43,P＜0.01)。pET21a/HBcAg-MIR-Epi1(1.035±0.111)組IgG抗體水平明顯高于PBS組(0

8、.134±0.02和pET21a/HBcAg-MIR對(duì)照組(0.241±0.04)(T1=7.521,P＜0.01;T2=5.692,P＜0.05pET21a/HBcAg-MIR-Epi1/Epi2/Epi3組(1.137±0.0680)也明顯高于PBS組(0.134±0.025)和pET21a/HBcAg-MIR對(duì)照組(0.241±0.04)(T1=5.292，P＜0.01;T2=8.836，P＜0.01);pET21a/HBcAg-

9、Epi1/Epi2/Epi3組較MIR-Epi1組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=1.47，P＞0.05);
　　細(xì)胞免疫:用LDH法檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞CTL細(xì)胞殺傷活性，結(jié)果顯示，在效靶比為20∶1時(shí)，小鼠脾細(xì)胞CTL殺傷效率最高，單因素方差分析，F(xiàn)=547.843，＜0.001。PBS組(4.882％±0.81％)的殺傷率最低，pET21a/HBcAg-MIR體對(duì)照組(6.332％±1.032％)的殺傷效率也很低僅高于PBS組;pET

10、21a/HBcAg-MIR-Epi1/Epi2/Epi3組(34.97500％±1.407％)的殺傷率最高pET21a/HBcAg-MIR-Epi組(30.992％±0.601％)次之。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，pET21a/HBcAg-MIR-Epi1組的殺傷效率明顯高PBS組和pET21 a/HBcAg-MIR載體對(duì)照組(T1=9.782，P＜0.01;T2=7.619，P＜0.01)，MIR-Epi1/Epi2/Epi3組顯著高于PBS組和M

11、IR載體對(duì)照組(T1=5.478，P＜0.01;T2=3.653，P＜0.01)，MIR-Epi1/Epi2/Epi3組高于pET21a/HBcAg-MIR-Epi1組，(T=2.547，P＜0.05);
　　[3]用ELISA法檢測(cè)病人血清標(biāo)本抗-Her-2自身抗體水平，結(jié)果顯示:乳腺癌病人抗-Her-2/neu自身抗體水平較高，疾病對(duì)照組次之，正常人最低。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，肽1孵育時(shí):乳腺癌病人組(0.965±0.092)血清特異

12、性抗提水平明顯高于乳腺纖維腺瘤組(0.505±0.055)和正常人組(0.476±0.05(T1=6.424，P＜0.05，T2=3.881，P＜0.05)，乳腺纖維腺瘤組(0.505±0.055)和正常人組(0.476±0.054)血清特異性抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。(T=0.987，P＞0.05);肽2孵育時(shí):乳腺癌病人組(0.915±0.081)血清特異性抗提水平明顯高于乳腺纖維腺瘤組(0.526±0.061)和正常人組(0.42

13、7±0.043)，(T1=7.544，P＜0.05;T2=4.172，P＜0.05)，乳腺纖維腺瘤組(0.526±0.061)和正常人組(0.427±0.043)血清特異性抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=1.465，P＞0.05);肽3孵育時(shí):乳腺癌病人組(0.922±0.076)血清特異性抗提水平明顯高于乳腺纖維腺瘤組(0.563±0.087)和正常人組(0.4430±0.048)(T1=6.038，P＜0.05;T2=4.281，P＜

14、0.05)，乳腺纖維腺瘤組和正常人組血清特異性抗體水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=0.548，P＞0.0S)。肽1孵育乳腺癌病人組、肽2孵育乳腺癌病人組、肽3孵育乳腺癌病人組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.883，P＞0.05)。
　　同時(shí)，計(jì)算了各組病人Her-2陽(yáng)性人數(shù)和陽(yáng)性率，乳腺癌病-Her-2/neu自身抗體水平較高，疾病病對(duì)照組次之，正常人最低。肽1孵育:乳腺癌病人組血清抗體陽(yáng)性率(42.708％)明顯高于正常人組(2.083

15、％)和乳腺纖維腺瘤組(6.25％)和(T1=18.475，P＜0.001; T2=14.336，P＜0.001)，正常人組(2.083％)乳腺纖維腺瘤疾病對(duì)照組(6.25％)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=3.422，P＞0.05).。肽2孵育:乳腺癌病人組血清抗體陽(yáng)性率(42.708％)明顯高于正常人組2.083％和乳腺纖維腺瘤組7.143％(T1=17.472，P＜0.001;T2=14.336，P＜0.001)，正常人組(2.083％)和乳

16、腺纖維腺瘤疾病對(duì)照7.143％差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=3.825，P＞0.05)。肽3孵育:乳腺癌病人組血清抗陽(yáng)性率(41.667％)明顯高于正常人組(1.389％)和乳腺纖維腺瘤疾病對(duì)照組(6.25％)(T1=17.472，P＜0.001; T2=14.336，P＜0.001)，正常人組(1.389％)和乳腺纖維腺瘤疾病對(duì)照組(6.25％)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(T=1.974，P＞0.05)。3個(gè)肽組進(jìn)行了組間差異分析，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2

17、0.543，P＞0.5)。
　　結(jié)論:
　　[1]成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET21a/HBcAg-Epi1、pET21a/HBcAg-Epi1/Epi2/Epi3，重組蛋白原核系統(tǒng)表達(dá)量高;
　　[2] pET21a/HBcAg(MIR)-Her-2串聯(lián)表位蛋白可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生血清特異性的抗-Her-2IgG抗體，可以有效刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生特異性的CTL反應(yīng)，具有較強(qiáng)的免疫原性。且pET21a/HBcAg(MIR)-Her-