帕金森病相關(guān)基因LRRK2蛋白的抗體制備、神經(jīng)解剖學(xué)分布及亞細(xì)胞定位.pdf

1、帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)是一種最常見的神經(jīng)退行性運(yùn)動障礙疾病，該病的特征是依賴年齡的靜止性震顫，肌肉強(qiáng)直，軀體麻痹，經(jīng)多巴胺的前體左旋多巴(L-dopa)治療后癥狀減輕。在年齡大于65歲的德國Bavarian人群中，PD的發(fā)病率為0.71％；在年齡大于50歲的新加坡人中，PD的發(fā)病率大約為0.30％。PD的病理學(xué)特征為黑質(zhì)致密部多巴胺能神經(jīng)元缺失，以及在剩余的多巴胺能神經(jīng)元中出現(xiàn)泛素陽性的Lewy小體。迄

2、今在染色體上已發(fā)現(xiàn)至少有九個位點(diǎn)與家族性PD相關(guān)，分別為PARK1-PARK9，PARK13，其中PARK1與PARK4為同一位點(diǎn)4q21。已克隆的PD相關(guān)基因有7個，其中α-synuclein、UCH-L1、LRRK2和Omi/HtrA2基因的突變可導(dǎo)致常染色體顯性(autosomal dominant，AD)遺傳PD，parkin、PINK1和DJ-1基因的突變則導(dǎo)致常染色體隱性(autosomal recessive，AR)PD。

3、 LRRK2基因有51個外顯子，編碼的蛋白多達(dá)2527個氨基酸，包含ANK、LRR、ROC、COR、Kinase和WD40等多個結(jié)構(gòu)域。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PD相關(guān)突變在LRRK2的各個結(jié)構(gòu)域中均有分布，尤以位于Kinase結(jié)構(gòu)域的G2019S最為常見。LRRK2的分子量大約280KD，在腦和其它器官以及細(xì)胞系HEK293T中均可表達(dá)，功能尚不清楚。已有的研究表明，LRRK2R1441C、G2019S、I2020T等PD相關(guān)突變導(dǎo)致LRR

4、K2激酶活性上升，細(xì)胞生活力下降，說明這些突變對細(xì)胞是有毒性的。而且，LRRK2參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元突起的形態(tài)建成，并在突觸囊泡蛋白的極性分布中起重要的作用。 Anti-LRRK2抗體是研究LRRK2功能重要的、必須的工具。通過DNAstar的Protean軟件分析LRRK2的氨基酸序列，選擇了三段長度在100個氨基酸左右、抗原性強(qiáng)、親水性好的多肽片段，將其編碼的核苷酸序列構(gòu)建至原核表達(dá)載體pGEX-4T-2，原核表達(dá)和純化得到了GS

5、T融合蛋白，然后免疫新西蘭雄兔，獲得了效價高、特異性好的anti-LRRK2兔多克隆抗體?？贵w用途分析實(shí)驗(yàn)表明，該抗體可用于Western B1otting，免疫組織化學(xué)，免疫細(xì)胞染色等實(shí)驗(yàn)。 利用自制的anti-LRRK2抗體，繪制出了LRRK2在小鼠腦中的分布圖，發(fā)現(xiàn)LRRK2在鼠腦中是廣泛表達(dá)的，但各神經(jīng)解剖學(xué)部位間有重要的不同；Western B1otting的結(jié)果表明LRRK2在大鼠腦各部位均可表達(dá)；在HEK293細(xì)胞