他汀類藥物抑制腦血管平滑肌細(xì)胞增殖及其與容積調(diào)節(jié)性氯通道的關(guān)系.pdf

1、腦卒中是最常見(jiàn)的腦血管疾病，是人類死亡的三大因素之一。已經(jīng)確認(rèn)高血壓是導(dǎo)致腦卒中的重要危險(xiǎn)因素之一。高血壓發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的血管重構(gòu)是引起腦卒中、心肌梗死等高血壓并發(fā)癥的病理基礎(chǔ)，形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為管徑變細(xì)、管壁增厚。其中平滑肌細(xì)胞的增殖被經(jīng)典地認(rèn)為是腦血管重構(gòu)的重要因素，有研究顯示在高血壓過(guò)程中，VSMC復(fù)制增加而相應(yīng)的細(xì)胞凋亡沒(méi)有增加，從而導(dǎo)致動(dòng)脈和小動(dòng)脈中膜層的增厚。 他汀類藥物，羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已經(jīng)

2、證明他汀類藥物具有“多效性”的作用，包括改善內(nèi)皮功能、抗氧化、增加NO合成、降低炎癥和平滑肌細(xì)胞增殖。這些效應(yīng)的作用機(jī)制可能與膽固醇合成的重要中間產(chǎn)物FPP和GGPP有關(guān)，這些類異戊二烯分子作為脂性基團(tuán)與轉(zhuǎn)錄后的一些信號(hào)蛋白分子如Ras，Rho共價(jià)結(jié)合后使之活化，從而激活其下游信號(hào)分子。許多研究表明活化的Rho蛋白參與了血管的許多重要的生理和病理過(guò)程，包括平滑肌收縮、細(xì)胞增殖、遷移和炎癥反應(yīng)。然而他汀類藥物抑制增殖的機(jī)制還不十分清楚。

3、 本課題在原代培養(yǎng)的大鼠基底動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞上觀察simvastatin對(duì)ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖的抑制作用及其與VRCC的關(guān)系。 第1章simvastatin對(duì)ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖的影響 采用CCK-8和BrdU摻入實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞記數(shù)法檢測(cè)simvastatin對(duì)ET-1和低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞增殖的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明： 1.10-8MET-1可引起B(yǎng)ASMCs增殖，用

4、CCK-8法檢測(cè)在450nm處的吸光度反應(yīng)細(xì)胞活力，三組與對(duì)照相比都有顯著性差異。在48小時(shí)時(shí)間點(diǎn)ET-1增殖率最高。 2.25％低滲培養(yǎng)基孵育BASMCs3h，6h，12h，24h，48h，50％低滲培養(yǎng)基孵育BASMCs12h后用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，25％低滲培養(yǎng)基孵育6h，12h，24h后的細(xì)胞活力都與對(duì)照組有顯著性差異，并以24h作用為最好。25％低滲培養(yǎng)基作用48h，50％低滲培養(yǎng)基作用12h反而使細(xì)胞活力比對(duì)照

5、降低。 3.simvastatin濃度依賴性的抑制10-8MET-1誘導(dǎo)的BASMCs的增殖。 4.simvastatin濃度依賴性的抑制低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BASMCs的增殖，以對(duì)照組為100％，則BrdU摻入實(shí)驗(yàn)顯示低滲培養(yǎng)基處理組。 5.20μMsimvastatin完全抑制10-8MET-1誘導(dǎo)的BASMCs的增殖。在培養(yǎng)基中同時(shí)加入100μM甲羥戊酸，10μMGGPP可以完全逆轉(zhuǎn)simvastatin的作用

6、。10μMFPP只能部分逆轉(zhuǎn)simvastatin的作用，增殖百分?jǐn)?shù)為110.2±3.7％，與單獨(dú)ET-1處理組和對(duì)照組之間都有顯著性差異。 6.20μMsimvastatin完全抑制25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BASMCs的增殖。在培養(yǎng)基中同時(shí)加入100μM甲羥戊酸，10μMGGPP可以完全逆轉(zhuǎn)simvastatin的作用。10μMFPP只能部分逆轉(zhuǎn)simvastatin的作用，與對(duì)照組之間沒(méi)有顯著性差異。 小結(jié)：

7、1.10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基都可以誘導(dǎo)BASMCs增殖。 2.simvastatin可以濃度依賴性地抑制10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的BASMCs增殖。 3.simvastatin的抑制效應(yīng)可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆轉(zhuǎn)，10μMFPP只能部分逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。100μM膽固醇完全不能逆轉(zhuǎn)simvastatin的效應(yīng)。0.25μg/mlC3和10μMY-27632可以模擬simvast

8、atin的效應(yīng)。 第2章simvastatin對(duì)容積調(diào)節(jié)性氯通道的作用及其調(diào)節(jié)機(jī)制 采用單細(xì)胞熒光影像分析系統(tǒng)和膜片鉗技術(shù)分析simvastatin對(duì)VRCC的影響及其調(diào)節(jié)機(jī)制。結(jié)果表明： 1.細(xì)胞外灌流液由310mosmol/kg·H2O轉(zhuǎn)換為230mosmol/kg·H2O低滲溶液后，可引起B(yǎng)ASMCs細(xì)胞內(nèi)氯離子的外流，經(jīng)校正后等滲和低滲細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度分別為31.0±1.3mM和21.8±1.4mM，細(xì)胞

9、內(nèi)氯離子降低比率為29.6±4.6％. 2.simvastatin濃度依賴性地抑制低滲誘導(dǎo)的氯離子的外流。simvastatin2.5，5，10，20μM等滲預(yù)敷細(xì)胞5分鐘后，換成低滲細(xì)胞外液灌流細(xì)胞。 3.細(xì)胞外灌流液中預(yù)先加入100μMMVA或10μMGGPP，5分鐘后再加入20μMsimvastatin可以完全阻斷simvastatin抑制氯離子外流的作用，與對(duì)照組低滲情況下胞內(nèi)氯離子濃度無(wú)顯著性差異。10μMFP

10、P只能部分阻止simvastatin的效應(yīng)，低滲細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度為26.3±0.7mM，與對(duì)照組和simvastatin組低滲情況下胞內(nèi)氯離子濃度相比都有顯著性差異。 4.0.25μg/mlC3預(yù)孵細(xì)胞4小時(shí)后，BASMCs由等滲換成低滲溶液灌流。 5.細(xì)胞外低滲溶液刺激下，BASMCs胞漿氯離子濃度從靜息時(shí)的31.7±2.5mM降低到21.0±1.5mM，接著應(yīng)用10μMY-27632能部分抑制低滲誘發(fā)的氯離子外流，抑

11、制率為20.1±6.9％。 6.在等滲細(xì)胞外液中直接加入ET-1不能直接激活氯離子的外流。10-8MET-1孵育細(xì)胞48小時(shí)后，灌注低滲溶液。 7.低滲溶液引起B(yǎng)ASMCs明顯腫脹，隨后激活一氯離子依賴性外向整流電流。該電流在正電位時(shí)緩慢失活。在胞內(nèi)外氯離子濃度相等條件下其反轉(zhuǎn)電位接近氯離子平衡電位。 8.simvastatin濃度依賴性地抑制Icl,vol，20μMsimvastatin預(yù)孵細(xì)胞5分鐘達(dá)到最大抑

12、制效應(yīng)。該抑制效應(yīng)沒(méi)有電壓依賴性。 9.100μMMVA和10μMGGPP預(yù)孵細(xì)胞可完全逆轉(zhuǎn)simvastatin的抑制Icl，vol效應(yīng)。 10.電極內(nèi)液孵育10μMY-27632顯著降低低滲激活的Icl,vol。抑制效應(yīng)沒(méi)有電壓依賴性。 小結(jié)： 1.在BASMCs上單細(xì)胞測(cè)細(xì)胞內(nèi)氯離子濃度和膜片鉗技術(shù)都顯示simvastatin能濃度依賴性地抑制低滲誘導(dǎo)的氯離子外流和Icl,vol。 2.si

13、mvastatin的抑制效應(yīng)可以被100μMMVA，10μMGGPP完全逆轉(zhuǎn)，10μMFPP只能部分逆轉(zhuǎn)此效應(yīng)。 3.0.25μg/mlC3預(yù)孵細(xì)胞4小時(shí)可明顯減低低滲誘導(dǎo)的氯離子外流，而低滲誘導(dǎo)VRCC開(kāi)放后再給予10μMY-27632僅微弱抑制氯離子外流。 4.10μMY-27632電極內(nèi)液給藥，能模擬simvastatin的效應(yīng)，抑制低滲細(xì)胞外液誘導(dǎo)的Icl,vol。 5.等滲情況下直接應(yīng)用ET-1不能激活

14、胞內(nèi)氯離子的外流，而當(dāng)ET-1預(yù)孵細(xì)胞48h后，在給予低滲細(xì)胞外液的情況下，可以加大氯離子外流的幅度。 第3部分VRCC在simvastatin抑制BASMCs增殖中的作用 通過(guò)在BASMCs上轉(zhuǎn)染豚鼠心室肌ClC-3cDNA全長(zhǎng)，采用BrdU摻入實(shí)驗(yàn)觀察ClC-3對(duì)simvastatin抑制細(xì)胞增殖的影響。并且通過(guò)simvastatin抑制增殖和抑制氯運(yùn)動(dòng)IC50值以及相關(guān)性的分析，闡述兩者之間的相互作用。結(jié)果如下：

15、 1.BASMCs轉(zhuǎn)染CIC-3cDNA后，10-8MET-1誘導(dǎo)的增殖率由未轉(zhuǎn)染的129.5±3.0％增加到143.7±2.7％，兩者之間有顯著性差異。 2.simvastatin能濃度依賴性地抑制10μMET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)染CIC-3BASMCs的增殖，但抑制率較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯降低。 3.simvastatin抑制10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的未轉(zhuǎn)染ClC-3BASMCs增殖的IC5

16、0值分別為3.2±0.04和3.4±0.50M，而轉(zhuǎn)染ClC-3后的IC50值分別為5.3±0.7和5.6±0.7μM，兩者之間有顯著性差異。 4.simvastatin抑制氯離子外流的IC50值為3.7±0.2μM，與其抑制細(xì)胞增殖的IC50值相近。 5.對(duì)simvastatin抑制10-8MET-1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和抑制低滲誘導(dǎo)的氯離子外流之間進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.94。simvastatin

17、抑制25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和抑制低滲誘導(dǎo)的氯離子外流之間也呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.84。 小結(jié)： 1.轉(zhuǎn)染ClC-3后simvastatin對(duì)10-8MET-1和25％低滲培養(yǎng)基誘導(dǎo)的增殖的抑制作用減弱。量效曲線右移。 2.simvastatin抑制氯離子外流和抑制增殖的IC50值相近，且之間有強(qiáng)的正相關(guān)性。 結(jié)論： 1.Simvastatin能濃度依賴性地抑制ET-1或低滲溶液誘導(dǎo)的BA