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1、[目的]: 本研究將大鼠肝細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞混合培養(yǎng)共微囊化后,移植入肝衰竭大鼠腹腔內(nèi),初步探討其對(duì)急性肝衰竭大鼠預(yù)后的影響及對(duì)肝組織內(nèi)心肌營(yíng)養(yǎng)素-1(cardiotrophin-1,CT-1)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3(signaltransducersandactivationoftranscription3,STAT3)、環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)的影響及意義。 [方法]:
2、 1、胰酶+EDTA灌注法分離大鼠肝細(xì)胞,膠原酶和胰酶二次消化法分離乳鼠睪丸支持細(xì)胞。 2、氣流切割法制備含肝細(xì)胞或含肝細(xì)胞與睪丸支持細(xì)胞以20:1混合的微囊3、大鼠隨機(jī)分為五組:A組(正常對(duì)照組);B組(肝衰竭模型組):腹腔注射D-氨基半乳糖(D-Gal)建立大鼠急性肝衰竭模型;C組(裸肝細(xì)胞組);D組(微囊化肝細(xì)胞組);E組(混合細(xì)胞共微囊化組)。后面三組在造模后18h分別腹腔注射2ml的裸肝細(xì)胞懸液、微囊化肝細(xì)胞懸液、微囊
3、化混合細(xì)胞懸液,造模后24、48、72、120和168h分別隨機(jī)取6只大鼠,動(dòng)態(tài)觀察肝臟病理學(xué)和血生化指標(biāo)。取肝組織用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)cox-2蛋白的表達(dá),半定量RT-PCR方法檢測(cè)CT-1、STAT3mRNA的表達(dá)。 [結(jié)果]: 1、原代肝細(xì)胞分離:大鼠肝細(xì)胞產(chǎn)量約為6×107/只,存活率大于90%;睪丸支持細(xì)胞純度達(dá)90%以上。 2、微囊直徑在600-800μm左右,且肝細(xì)胞、睪丸支持細(xì)胞在微囊化前后存活
4、率對(duì)照發(fā)現(xiàn)兩者沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。 3、腹腔注射D-Gal24h后,肝病理學(xué)表現(xiàn)為大鼠肝索結(jié)構(gòu)破壞,小葉結(jié)構(gòu)模糊不清,肝細(xì)胞廣泛壞死,壞死區(qū)周?chē)渭?xì)胞發(fā)生不同程度的氣球樣變及嗜酸性變,小葉內(nèi)及匯管區(qū)有淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn),這表明急性肝功能衰竭動(dòng)物模型成功建立。 4、各組大鼠肝功能檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn),造模后6h,模型組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門(mén)冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)就開(kāi)始顯著(P<0.05),到4
5、8h達(dá)高峰,72小時(shí)后開(kāi)始顯著下降(P<0.05)。造模48h后,各治療組ALT、AST較模型組顯著下降(P<0.05),以混合共微囊組為著。 5、造模后7d,發(fā)現(xiàn)大鼠腹腔內(nèi)微囊多聚集于大網(wǎng)膜及腸系膜之間,未見(jiàn)粘連情況。光鏡下觀察發(fā)現(xiàn),微囊有不同程度的變形,部分微囊可見(jiàn)少量的松散纖維包裹,但微囊內(nèi)仍可見(jiàn)游離的肝細(xì)胞或混有散在的睪丸支持細(xì)胞。兩組的微囊形態(tài)學(xué)改變表現(xiàn)無(wú)明顯差異。 6、肝組織中CT-1mRNA正常組很少表達(dá),
6、造模后12h,模型組開(kāi)始顯著升高(P<0.05),到48小時(shí)達(dá)高峰,混合微囊組CT-1在72h、120h、168h均高于其他各組。STAT3的表達(dá)在造模后6h較正常組顯著升高(P<0.05),48h達(dá)最高峰。各治療組在造模后48h的表達(dá)量較模型組顯著升高(P<0.05),混合微囊組更為顯著。免疫組化結(jié)果表明正常組未見(jiàn)COX-2蛋白表達(dá),其他各組可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá),以中央靜脈匯管區(qū)及壞死區(qū)周?chē)磉_(dá)最為明顯。造模后6h表達(dá)量逐漸增多,至48-72
7、h時(shí)達(dá)高峰,各治療組在48h后較模型組升高。 [結(jié)論]: 1、采用胰酶+EDTA灌注法分離肝細(xì)胞,可獲得較高產(chǎn)量和活力的肝細(xì)胞,與膠原酶分離法相比,大大節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。 2、采用膠原酶+胰酶二步消化法分離睪丸支持細(xì)胞,可獲得較高純度和數(shù)量的睪丸支持細(xì)胞。 3、海藻酸鈉-多聚賴氨酸-海藻酸鈉制備微囊效果理想,微囊制作技術(shù)可行性高,但仍需進(jìn)一步提高微囊的穩(wěn)定性和均一性。 4、混合肝微囊化移植組對(duì)肝衰竭
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