FTY-720對(duì)EAE小鼠的治療作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis，MS)是一種T細(xì)胞介導(dǎo)，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)(centralnervous system，CNS)局灶性髓鞘脫失為主要病理改變的慢性自身免疫性疾病。該病的病變位于腦部或脊髓，神經(jīng)病理主要表現(xiàn)為局灶性脫髓鞘、少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡、軸突變性以及星型膠質(zhì)細(xì)胞的增生，目前MS的發(fā)病機(jī)制尚未明確。
　　 在我國(guó)，隨著人們的生活習(xí)慣和生態(tài)環(huán)境改變，以及對(duì)MS的認(rèn)識(shí)和診斷水平的提高，MS已成為臨床常見(jiàn)的

2、神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。目前MS的治療主要依賴(lài)藥物，包括糖皮質(zhì)激素、β干擾素和乙酰格雷替酮等，但這些藥物只對(duì)部分MS病人有效，仍有相當(dāng)部分患者飽受無(wú)藥可治的痛苦，成為急待解決的問(wèn)題。因此，通過(guò)建立MS的動(dòng)物模型來(lái)探討MS的發(fā)病機(jī)制及臨床治療是目前迫切的醫(yī)學(xué)研究工作。
　　 實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是人為地用免疫原免疫易感動(dòng)物產(chǎn)生的一種CD4+

3、輔助性T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性、炎性、脫髓鞘性、腦脊髓炎，是研究自身免疫性疾病常用的動(dòng)物模型。EAE具有與多發(fā)性硬化相似的臨床和病理特點(diǎn)，被公認(rèn)為MS的理想模型，慢性復(fù)發(fā)性EAE(Chronic relapsing EAE，Cr-EAE)，與“復(fù)發(fā)-緩解型”MS相似。因此，通過(guò)EAE的實(shí)驗(yàn)研究對(duì)于探討MS的病理特點(diǎn)、發(fā)病機(jī)制和治療效果頗有價(jià)值。
　　 FTY-720:是近幾年新開(kāi)發(fā)的一種免疫抑制劑，該藥選擇性減少外周血液循環(huán)中的T

4、淋巴細(xì)胞數(shù)量，作用機(jī)制獨(dú)特，免疫抑制效果強(qiáng)大，毒副作用小?？诜﨔TY-720在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物器官移植中具有免疫抑制活性，關(guān)于FTY-720誘導(dǎo)免疫耐受的研究目前還不多。2012年最新文獻(xiàn)報(bào)道了FTY-720在移植中的分子作用機(jī)制，基于此理論基礎(chǔ)，我們探討FTY-720對(duì)EAE的治療作用及其機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建MS的動(dòng)物模型EAE小鼠，在此平臺(tái)開(kāi)展“藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)、作用機(jī)制探討”二大部分的實(shí)驗(yàn)研究，分別探討FTY-720對(duì)EAE的免

5、疫抑制作用及FTY-720對(duì)EAE的作用機(jī)制。希望通過(guò)對(duì)EAE的實(shí)驗(yàn)研究，進(jìn)一步認(rèn)識(shí)中樞神經(jīng)脫髓鞘疾病的免疫發(fā)病機(jī)制及病理改變特點(diǎn)，為MS的基礎(chǔ)研究與臨床治療探索新的途徑。
　　 目的:
　　 第一部分:FTY-720對(duì)EAE的免疫作用
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建EAE小鼠模型，探討EAE的典型臨床與病理特點(diǎn);通過(guò)觀(guān)察EAE發(fā)病早期應(yīng)用免疫抑制劑FTY-720治療后其病程變化及病理特點(diǎn)，探討免疫抑制治療對(duì)EAE發(fā)病的干

6、預(yù)作用。
　　 第二部分:FTY-720對(duì)EAE的作用機(jī)制
　　 本實(shí)驗(yàn)擬開(kāi)展體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察FTY-720對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖與凋亡的影響、體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)觀(guān)察FTY-720對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞的抑制作用、檢測(cè)EAE小鼠脊髓組織細(xì)胞因子及胞內(nèi)信號(hào)分子的表達(dá)來(lái)篩選FTY-720影響炎癥因子表達(dá)的信號(hào)通路及信號(hào)蛋白，探討FTY-720的作用機(jī)制。
　　 方法:
　　 第一部分:藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)
　　

7、 本實(shí)驗(yàn)采用“前瞻性隊(duì)列研究”設(shè)計(jì)方案，經(jīng)MOG35-55主動(dòng)誘導(dǎo)C57BL/6小鼠構(gòu)建慢性單相型EAE模型，分為病例組與三個(gè)干預(yù)組，病例組喂食生理鹽水治療，干預(yù)組喂食不同劑量免疫抑制劑FTY-720，分別觀(guān)察病程中四組小鼠的體重、臨床評(píng)分、發(fā)病率等臨床指標(biāo)特點(diǎn)，并于實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)時(shí)間觀(guān)察EAE小鼠脊髓的病理特點(diǎn)，四組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析。
　　 第二部分:生化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
　　 本實(shí)驗(yàn)采用“流式細(xì)胞儀”檢測(cè)EAE小鼠體外培養(yǎng)的CD

8、4+T淋巴細(xì)胞增殖與凋亡程度，評(píng)估FTY-720對(duì)EAE小鼠體外CD4+T淋巴細(xì)胞是否有免疫抑制作用;采用“流式細(xì)胞儀”檢測(cè)EAE小鼠經(jīng)FTY-720治療后脾臟血CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量變化，評(píng)估FTY-720對(duì)EAE小鼠體內(nèi)CD4+T淋巴細(xì)胞的免疫抑制效果;采用“Rt-PCR”檢測(cè)EAE小鼠脊髓組織炎癥因子表達(dá)，評(píng)估FTY-720對(duì)炎癥因子表達(dá)變化的影響;采用“Western blot”檢測(cè)實(shí)驗(yàn)小鼠脊髓組織細(xì)胞胞內(nèi)信號(hào)蛋白的表達(dá)，篩選F

9、TY-720影響炎癥因子表達(dá)的信號(hào)通路及信號(hào)蛋白。
　　 結(jié)果:
　　 第一部分:FTY-720對(duì)EAE的免疫作用
　　 1、病例組EAE小鼠:臨床神經(jīng)功能評(píng)分、體重及發(fā)病率等呈現(xiàn)慢性單相表現(xiàn)，存在“發(fā)病-非緩解”現(xiàn)象，具備典型MS發(fā)病過(guò)程;其病理觀(guān)察也表現(xiàn)典型炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失等病理特點(diǎn)。
　　 2、干預(yù)組EAE小鼠:臨床神經(jīng)功能評(píng)分、體重及發(fā)病率等呈單相表現(xiàn)，其病理觀(guān)察雖有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、髓鞘脫失等

10、特點(diǎn)，但與病例組比較，臨床癥狀及病理特點(diǎn)均不典型。
　　 第二部分:FTY-720對(duì)EAE的作用機(jī)制
　　 1、體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示:FTY-720干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)小鼠CD4+T淋巴細(xì)胞增殖減少、凋亡增加，提示FTY-720可抑制CD4+T淋巴細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡。
　　 2、體內(nèi)藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示:FTY-720干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)小鼠脾臟血CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量減少，提示FTY-720可減少外周血CD4+T淋巴細(xì)胞的激活

11、。
　　 3、細(xì)胞因子表達(dá)檢測(cè)顯示:提示FTY-720可抑制CD4+T淋巴細(xì)胞分泌IL-10、IL-17等特異性炎癥因子，并可抑制IL-2、IL-6、TNF-α、iNOS、INF-Y等非特異性炎癥因子的分泌，但對(duì)IL-4細(xì)胞因子的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　 4、信號(hào)分子表達(dá)檢測(cè)顯示:經(jīng)FTY-720干預(yù)后，EAE小鼠脊髓cPLA2的表達(dá)下降。
　　 結(jié)論:
　　 第一部分:FTY-720對(duì)EAE的免疫抑制作用

12、
　　 1、臨床評(píng)估:用MOG35-55誘導(dǎo)C57BL/6小鼠，可成功構(gòu)建“慢性單相”EAE模型。
　　 2、干預(yù)評(píng)估:早期應(yīng)用免疫抑制劑FTY-720，可減輕EAE臨床神經(jīng)功能評(píng)分、可減少EAE的發(fā)生、改變EAE的病程。
　　 3、藥量評(píng)估: FTY-7200.3mg/kg/d可有效減少EAE的發(fā)生。
　　 第二部分:FTY-720對(duì)EAE的免疫作用機(jī)制
　　 1、抑制EAE小鼠外周血CD4+T