應用蛋白質(zhì)芯片技術研究HBV慢性肝病中醫(yī)證型與細胞因子的相關性.pdf

1、目的：細胞因子是指由細胞分泌的具有生物活性的小分子蛋白物質(zhì)的統(tǒng)稱，研究發(fā)現(xiàn)HBV慢性肝病的發(fā)生、發(fā)展及其演變與細胞因子密切相關。蛋白芯片是繼基因芯片后發(fā)展起來的一種新的生物檢測技術，它的出現(xiàn)對于生物學、臨床檢驗醫(yī)學、遺傳學、腫瘤學和藥理學等多學科的進步具有極大的推動作用。目前國內(nèi)檢測細胞因子通常采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，但ELISA存在著靈敏度較低、重復性較差、分析范圍較窄等問題，而具有快速、并行、自動化和高通量的特點蛋白芯片

2、則可以彌補這些缺點。因此參考國內(nèi)外文獻，選取IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、sICAM-1、TGF-β<,1>、TIMP-1等7種細胞因子做為研究靶點，自行構建蛋白芯片，分析蛋白芯片技術與傳統(tǒng)的ELISA敏感性和特異性的差別；并借助蛋白芯片技術研究這7種細胞因子在不同類型的HBV慢性肝病中變化規(guī)律，尋求能夠準確反應肝臟炎癥及纖維化程度的新指標；探討慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中醫(yī)證型與7種細胞因子的相關性，尋求中西

3、醫(yī)的交融之處，豐富中醫(yī)“證”的微觀指標學說，為慢性肝病中醫(yī)“證”的客觀化和規(guī)范化研究奠定基礎。 方法：將洗凈的載玻片放入以1:50丙酮稀釋的APES中，停留20～30s，取出后再用純丙酮溶液沖洗。將7種血清標志物的單克隆抗體用PBS(0.01mol/L，pH7.0)稀釋為500mg/L，用Cartisian 5500機器人點樣于APES玻片上，每個樣品設4個重復。將芯片放于37℃孵育4h，用PBST洗滌3×15s，用封閉液于37

4、℃封閉2h，用PBST洗滌3次×15s，晾干備用。以500mg/L生物素標記的BSA為陽性對照，用無生物素標記的500mg/L BSA為陰性對照。從-80℃冰箱中取出血清樣品，置冰盒上溶解后，以5000g，4℃離,~'5min。取10μl血清，用樣本稀釋液稀釋10倍，400～600r/min冰浴震蕩30min。運用點樣儀向每個反應孔中加入100μl處理好的樣品，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，然后加入生物素標記的7種細胞因子的單克隆抗

5、體20μl(濃度為1μg/ml)，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，再加入Cy3標記的親和素，37℃孵育1h，PBST洗滌3次，晾干。將蛋白芯片用ScanArray4000激光共聚焦掃描儀掃描成像，掃描后的圖象用Imagene軟件分析熒光強度，對所有原始數(shù)據(jù)根據(jù)單個膜陽性與陰性對照值進行標準化處理及減除背景處理，取4個反應孔熒光強度的平均值，通過標準曲線計算與分析結果。將蛋白芯片結果與ELISA檢測結果進行比較后，選擇慢性乙型病毒性肝炎

6、患者90例，其中輕、中、重度各30例，參照1991年天津會議所制定的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準(試行)》進行辨證分型，濕熱中阻型20例，肝郁脾虛型26例，瘀血阻絡型21例，肝腎陰虛型14例，脾腎陽虛型9例；乙肝肝硬化患者共90例，A、B、C級各30例，中醫(yī)辨證參考1993年洛陽會議所制定的《肝硬化臨床診斷、中醫(yī)辨證和療效評定標準(試行方案)》，其中肝氣郁結22例，脾虛濕盛18例，濕熱內(nèi)蘊12例，肝腎陰虛7例，脾腎陽虛11例，血瘀證20例；

7、慢性重型乙型病毒性肝炎30例。借助蛋白芯片技術明確7種細胞因子在不同類型HBV慢性肝病的變化規(guī)律，并探討其與中醫(yī)證型的相關性。 結果：(1)成功構建血清細胞因子蛋白芯片，并建立良好的質(zhì)控標準。預實驗中比較了蛋白芯片與ELISA對IL-2、IL-4、TNF-α3種因子的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)在對34例臨床標本的檢測中，蛋白芯片及ELISA法均未能檢測到IL-2、IL-4，而蛋白芯片卻檢測到8例慢性乙肝重度患者血清中的TNF-α，ELIS

8、A法僅檢測出其中的5例。(2)慢性肝病組7種細胞因子與正常對照組均有顯著差異(P<0.05)，IL-2、IFN-γ等Th1類細胞因子在慢乙肝輕度中水平基本正常，慢重肝患者濃度最低(P<0.01)；慢重肝Th2類細胞因子IL-4高達258.56±36.72 pg/ml，與其它組有顯著差異(P<0.01)，具體變化規(guī)律為輕度

9、1>為輕度<中度<重度 sICAM-1及TIMP-1均較

10、正常組顯著升高(P<0.01)，濕熱內(nèi)阻證TNF-α濃度為433.58±24.44 pg/ml，上升幅度最大，TGF-β<,1>、sICAM-1及TIMP-1則以瘀血內(nèi)阻證升高最明顯；肝郁脾虛及濕熱內(nèi)阻證患者血清IFN-γ與正常組無差異，而另外3種證型IFN-γ水平均顯著低于正常組(P<0.01)。(4)肝硬化患者除濕熱內(nèi)阻型血清IFN-γ(62.68±8.56 pg/ml)與正常對照組無顯著差異外，其余各證型患者血清細胞因子均與正常組

11、有顯著差異(P<0.01)；脾虛濕盛、脾腎陽虛、血瘀證3型IL-2水平顯著低于肝氣郁結(P<0.01)，而IL-4、TNF-α水平較肝氣郁結顯著升高(P<0.01)；TGF-β<,1>、sICAM-1在濕熱內(nèi)阻型中水平最低(P<0.05～0.01)；TIMP-1則在肝氣郁結中濃度167.88±14.21 ng/ml，與其它證型有顯著差異(P<0.05～0.01)；濕熱內(nèi)阻證IFN-γ濃度為62.68±8.56 pg/ml，與肝氣郁結證(

12、58.37±9.75 pg/ml)無顯著差異，其余證型均低于肝氣郁結證(P<0.01)。 結論：蛋白芯片技術檢測血清細胞因子較傳統(tǒng)的EL,ISA具有更高的敏感性和可重復性；HBV慢性肝病患者血清細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、TNF-α、sICAM-1、TGF-β<,1>、TIMP-1的水平在一定程度上可反應肝臟炎癥及纖維化程度；慢性乙型病毒性肝炎、乙肝肝硬化患者不同中醫(yī)證型與血清細胞因子有一定相關性，可以將細胞因子納入