相對低劑量己烯雌酚對小鼠睪丸引帶細胞PKC-PKA通路的影響.pdf

1、目的：
　　目前大量研究資料證實外源性雌激素（EEs）與雄性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常（畸形）密切相關，其具體影響及作用機理尚不明確。既往大多研究集中在對雄性生殖系統(tǒng)的核心器官睪丸的研究上，對與睪丸發(fā)育及下降密切相關的睪丸引帶（gubernaculum testis）的研究甚少。睪丸引帶對睪丸的下降發(fā)育過程起著引導、牽引，以及固定等作用。既往研究發(fā)現(xiàn)己烯雌酚（DES），一種經(jīng)典的EEs導致小鼠睪丸引帶組織的形態(tài)結構及細胞的增殖和收縮功能異常

2、，并發(fā)現(xiàn)DES作用于睪丸引帶細胞引起[Ca2+]i瞬時變化，提示可能與細胞鈣通道信號通路有關。本實驗針對PLC酶抑制劑U-73122預作用下，相對低劑量DES對小鼠睪丸引帶細胞[Ca2+]i和CREB蛋白磷酸化水平的影響，探討PKC/PKA信號通路在相對低劑量DES影響小鼠睪丸引帶細胞中的作用，以進一步了解DES影響睪丸引帶細胞增殖性和收縮功能的作用機理，或有助于揭示EEs影響睪丸下降發(fā)育，甚至影響泌尿生殖系統(tǒng)發(fā)育的可能機理。
　

3、　方法：
　　將培養(yǎng)的傳代小鼠睪丸引帶細胞隨機分為空白對照組（0.01％PBS，v/v）、溶劑對照組（0.01%DMSO組，v/v）、U-73122實驗組1-6（U-73122終濃度分別為0.1、0.25、0.5、1、5和10μmol/L）、DES組（1.5×10-8 mol/L DES）和U-73122+DES組（1μmol/L U-73122預先作用細胞10 min后再加入1.5×10-8 mol/L DES）共10組。分別采

4、用共聚焦顯微鏡[Ca2+]i測定法、CCK-8分析法及Western Blot方法檢測PLC酶抑制劑U-73122對小鼠睪丸引帶細胞生長狀態(tài)和細胞[Ca2+]i的影響以及PLC酶抑制劑U-73122干預后相對低劑量DES對小鼠睪丸引帶細胞增殖性、[Ca2+]i和CREB磷酸化蛋白（P-CREB）表達的影響。
　　結果：
　　1.1μmol/L及低于此濃度的U-73122作用于睪丸引帶細胞，小鼠睪丸引帶細胞形態(tài)和生長狀態(tài)正常。

5、U-73122濃度≥5μmol/L時引帶細胞出現(xiàn)大部分死亡。U-73122各組加藥瞬間小鼠睪丸引帶細胞內(nèi)游離鈣離子的熒光強度變化率[(F0-Fmin)/F0]為12.58%、18.72%、38.96%、55.81%、63.59%、95.17%，與溶劑對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　2.DES可影響睪丸引帶細胞的增殖性，并存在時間-效應關系（r=0.9193）。與同時間段DES組相比較，U-73122+DES組O

6、D值明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　3.DES組加藥瞬間細胞內(nèi)游離鈣離子的熒光強度變化率[(Fmax-F0)/F0]為143.32%，與溶劑對照組相比較，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。U-73122+DES組的熒光強度變化率為15.57%，與DES組相比較，差別有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　4.DES組能在3 h內(nèi)不同程度誘導細胞p-CREB表達增加，與溶劑對照組相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0

7、.05）。與同時間段DES組相比較，U-73122+DES組（除30min外）p-CREB的表達均明顯降低，差別具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。
　　結論：
　　1.PLC酶抑制劑U-73122影響小鼠睪丸引帶細胞[Ca2+]i水平，且存在劑量--效應關系。1μmol/L U-73122對睪丸引帶細胞正常生長無明顯影響。采用1μmol/L U-73122探討DES對睪丸引帶細胞中PKC/PKA通路的影響。
　　2.PL