人睪丸生精新基因SPAG4L的初步研究.pdf

1、在男性不育疾病中，生精障礙及其相關(guān)疾病是重要的一個組成部分。許多基因參與了精子生成，成熟，運動等方面的調(diào)控。有研究表明，大約2000多個不同的基因參與了男性生殖的各個方面[1，2]：睪丸發(fā)育，生殖細胞分化，減數(shù)分裂以及精子發(fā)生等階段。其中不少生精相關(guān)基因的功能已經(jīng)被充分研究，但是很大一部分基因的功能如何?與其他的基因怎樣相互調(diào)控來影響人類生殖的不同階段尚不完全清楚。因此對人類生精相關(guān)基因的研究具有重要意義。
　　 SUN家族是目

2、前研究比較多的一個基因家族。SUN中文全稱Sad-1/Unc-84家族。早期在探討真核細胞的核移動、核重定位、核膜重構(gòu)等過程中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)核膜蛋白Unc-84起到了關(guān)鍵作用[1]。后來又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)部分SUN家族成員參予精子發(fā)生過程[3，4]。SUN家族成員的重要結(jié)構(gòu)特征是肽鏈C端有一個高度保守的SUN domain氨基酸序列，靠近N端有跨膜區(qū)(TM)，跨膜區(qū)和SUN domain之間有coiled-coil區(qū)。在人類蛋白中，SUN家族目前已發(fā)

3、現(xiàn)的成員有五位：SUN1、SUN2、SUN3、SPAG4(又稱SUN4)和SPAG4L(又稱SUN5或者TSARG4)。
　　 SUN家族成員參予了精子發(fā)生過程：在小鼠精子尾部形成過程中，Xueping Shao等發(fā)現(xiàn)，SPAG4蛋白通過亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，與Odf1(小鼠精子尾部纖維蛋白)相互作用，在精子尾部發(fā)生中起重要作用[3]；在哺乳動物精子頭部形成過程中，Sun3與外核膜蛋白Nesprin1作用，Sun1與外核膜蛋白Nesp

4、rin3作用，將細胞核和細胞質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)聯(lián)系起來，在確保精子頭部形成方面起重要作用[4]。我院中心實驗室邢曉為老師在早期研究中，從SPAG4出發(fā)，克隆了人類睪丸新基因SPAG4L[5]，并于2001年7月率先向GenBanK提交了該序列(GenBanK登錄號：AF401350)，隨后克隆了SPAG4L的小鼠同源基因spag41(又名SRG4)(GenBanK登錄號：AY307077)。
　　 在早期的動物模型實驗中發(fā)現(xiàn)，多組織的R

5、T-PCR和Northern blot結(jié)果顯示人SPAG4L的小鼠同源基因spag41在小鼠睪丸組織中特異性表達，在其它組織中無明顯表達；在研究小鼠同源基因spag41表達水平變化時發(fā)現(xiàn)，RT-PCR結(jié)果顯示小鼠出生2周內(nèi)，spag41表達量極低；3周開始，spag41開始大量表達；到4～5周時表達量到達最高，說明小鼠同源基因spag41可能在小鼠精子發(fā)育中起重要作用[6]。組織原位雜交結(jié)果顯示，spag41在正常小鼠睪丸中大量表達，主

6、要表達于精母細胞和圓形精子細胞中；而在手術(shù)隱睪模型中，生殖細胞大量凋亡，精曲小管空泡化，僅在精曲小管管壁殘存的生殖細胞中可見個別spag41棕黃色陽性雜交信號。正常睪丸和隱睪陰性對照中均未見spag41陽性雜交信號。表明spag41可能對小鼠精子的生長發(fā)育起調(diào)控作用。
　　 以上動物實驗結(jié)果均提示小鼠同源基因spag41在小鼠的精子發(fā)育過程中起重要作用。而對于人類基因SPAG4L基因的功能和特點，目前所知甚少。在本研究中，我們對

7、SPAG4L的蛋白家族歸屬、時間和空間表達特性；SPAG4L蛋白的原核表達與純化；亞細胞定位以及SPAG4L蛋白在精子減數(shù)分裂發(fā)生中的變化等方面進行了初步探討。
　　 第一章 SPAG4L生物學(xué)信息學(xué)分析和表達特點
　　 目的：研究人睪丸生精新基因SPAG4L與已知的SUN蛋白家族成員的同源性分析，了解其蛋白家族歸屬；了解SPAG4L的組織表達特異性和時空表達特異性。
　　 方法：將SPAG4L基因全長序列與其他

8、SUN家族成員基因序列比對，進行同源性分析。用Northern blot，RT-PCR，原位雜交等方法對SPAG4L的表達特性進行研究。
　　 結(jié)果：SPAG4L是SUN蛋白家族的一個新成員，并且與SUN3，SPAG4來源于同一個祖先。SPAG4L在睪丸組織中特異性表達，而在其余組織中無明顯表達，說明其是一個睪丸特異性基因。SPAG4L主要是在成年男性睪丸中高表達，在胎兒睪丸中無表達；SPAG4L蛋白主要表達在精原細胞和精母細胞

9、，在成熟精子中不表達。
　　 結(jié)論：SPAG4L是SUN家族的一個新成員；在睪丸組織中特異性表達且與睪丸成熟度有關(guān)；SPAG4L蛋白主要在精子發(fā)生減數(shù)分裂過程早期階段出現(xiàn)，在成熟精子和長形精子中無表達。為我們進一步深入研究SPAG4L在精子發(fā)生機制，在減數(shù)分裂中的作用打下一定基礎(chǔ)。
　　 第二章SPAG4L的原核表達和純化
　　 目的：通過構(gòu)建原核表達質(zhì)粒PQE-30-SPAG4L，對SPAG4L基因在大腸桿菌中

10、誘導(dǎo)表達并進行純化，獲得純化SPAG4L蛋白并進行驗證。
　　 方法：取人新鮮睪丸組織，提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴增SPAG4L基因編碼序列；將該基因克隆到表達載體PQE30中，構(gòu)建原核表達載體PQE-30-SPAG4L，用限制性內(nèi)切酶酶切分析及DNA序列分析鑒定重組質(zhì)粒；將測序驗證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM15后誘導(dǎo)原核表達，并用NI-NTA磁性瓊脂糖珠對表達出的融合蛋白進行純化。并用Wester

11、n Blot法對目的蛋白進行驗證。
　　 結(jié)果：RT-PCR擴增出SPAG4L的(TSARG4)基因編碼序列，目的插入片段長約253bp；產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，成功連接到表達質(zhì)粒PQE-30。重組質(zhì)粒PQE-30-SPAG4L經(jīng)酶切鑒定構(gòu)建成功；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM15后進行誘導(dǎo)并原核表達，獲得帶有6個組氨酸標(biāo)簽的融合蛋白6×His-SPAG4L。用NI-NTA磁性瓊脂糖磁珠純化6×His-SPAG4L蛋白，并 West

12、ern Blot鑒定純化蛋白成功。
　　 結(jié)論：成功構(gòu)建了人睪丸基因SPAG4L(TSARG4)的原核表達載體PQE-30-SPAG4L并體外表達成功；所獲得純化6×His-SPAG4L蛋白可以用于下個階段，對于SPAG4L蛋白功能學(xué)和蛋白相互作用等方面的研究。
　　 第三章 SPAG4L的亞細胞定位及其在減數(shù)分裂中的變化
　　 目的：研究人SPAG4L蛋白的亞細胞空間定位，并明確對SPAG4L蛋白的精細亞細胞定

13、位起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域。并初步觀察人SPAG4L蛋白的小鼠同源基因spag41在小鼠精子減數(shù)分裂中的變化。
　　 方法：構(gòu)建包含不同結(jié)構(gòu)域的EGFP-N1-SPAG4L突變體的表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HeLa細胞，通過激光共聚焦觀察綠色熒光蛋白發(fā)光情況，了解不同SPAG4L突變體的亞細胞定位情況，觀察不同結(jié)構(gòu)域?qū)Σ煌琒PAG4L突變體其亞細胞定位變化的影響；用免疫熒光雙標(biāo)的方法，觀察其小鼠同源蛋白spag41和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標(biāo)志蛋白PDI、核膜標(biāo)志

14、蛋白Lamin B1共定位情況；通過免疫熒光觀察其小鼠同源蛋白spag41在小鼠精子減數(shù)分裂中的變化并初步分析其意義。
　　 結(jié)果：SPAG4L蛋白主要定位于核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。其跨膜區(qū)(TM)和coiled-coil區(qū)對SPAG4L蛋白精確亞細胞定位是必需的，C端的SUN區(qū)對SPAG4L蛋白亞細胞定位無影響；在減數(shù)分裂中，其小鼠同源蛋白spag41可能參與了細胞核遷移、定位和核膜重構(gòu)。
　　 結(jié)論：SPAG4L是一個核膜和內(nèi)