SLFN11基因表達水平影響人腸癌細胞株對SN38的敏感性.pdf

1、目的:
　　結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是一種常見的發(fā)病率及死亡率較高的惡性腫瘤，化療在其治療手段中占有重要地位。CPT-11是CRC的主要治療藥物之一，但是其療效因耐藥性的產(chǎn)生和毒性反應(yīng)受到限制。目前尚未有明確的CPT-11療效預(yù)測因子。因此找出CPT-11療效預(yù)測因子，對于指導(dǎo)CRC患者個體化治療，具有重要的意義。
　　近兩年體外研究發(fā)現(xiàn)SLFN11基因表達水平與CPT-11敏感性高度相關(guān)。SL

2、FN11基因是SLFN(Schlafen)家族中人源性成員之一。1998年， Schwarz等研究者發(fā)現(xiàn)SLFN家族基因SLFN1，參與調(diào)控胸腺發(fā)育。隨后不斷發(fā)現(xiàn)的SLFN家族其它成員的主要功能是調(diào)控細胞生長和分化。SLFN基因家族因為對細胞生長起重要的負調(diào)控作用，因此很可能是一種潛在的抑癌基因。SLFN11在多種腫瘤細胞系中廣泛表達，而且表達水平具有一定的分布范圍。在卵巢癌和CRC中，腫瘤組織的SLFN11分布明顯大于周圍的正常組織。

3、研究者通過大規(guī)模腫瘤細胞系的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)SLFN11基因高表達細胞對CPT-11的療效好;但機制尚不明確。
　　本研究旨在對人源性結(jié)直腸癌細胞系進行SLFN11基因功能與CPT-11的敏感性的相關(guān)研究。進一步觀察SLFN11基因表達對腸癌細胞系的CPT-11敏感性的影響，為探索CPT-11療效預(yù)測分子提供科學(xué)依據(jù)。
　　方法:
　　(1)實時定量PCR、Western blot法檢測八種人腸癌細胞株（LOVO、H

4、CT-8、HT-29、SW-480、DiFi、HCT-116、CaCo2、、LS174T）中SLFN11的mRNA及蛋白表達水平。篩選出SLFN11表達高、低細胞株。
　　(2)脂質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)染SLFN11 siRNA至細胞株，獲得低表達SLFN11的體外細胞研究模型。采用Western blot等技術(shù)驗證下調(diào)SLFN11的效果。
　　(3)轉(zhuǎn)化SLFN11基因至HCT8細胞株。構(gòu)建pcDNA3.1(+)-SLFN11質(zhì)粒和E

5、XN91 mAb標(biāo)記的負電荷AuNP載體。設(shè)同型mAb標(biāo)記的AuNP載體做對照，同時使用傳統(tǒng)Lipofectamine2000載體做比較，將SLFN11基因?qū)際CT8細胞。用熒光顯微鏡觀察不同載體介導(dǎo)的SLFN11基因轉(zhuǎn)化率，用Western blot方法檢測轉(zhuǎn)化細胞的SLFN11蛋白表達水平。
　　(4)選取CPT-11的活性代謝產(chǎn)物SN-38對細胞株干預(yù)24h或48h。MTT法檢測SLFN11siRNA干預(yù)或過表達對SN-3

6、8抑制人腸癌細胞生存率的影響。
　　(5) PI雙染法流式細胞術(shù)檢測SLFN11基因表達水平對SN-38誘導(dǎo)細胞凋亡率的影響。
　　(6)流式細胞術(shù)檢測SLFN11基因表達水平對SN-38誘導(dǎo)細胞周期阻滯的影響。
　　結(jié)果:
　　(1) SLFN11基因在八種腸癌細胞株中存在差異性表達，該基因的mRNA和蛋白表達水平表現(xiàn)為一致。SLFN11在HCT8、HCT116細胞株中表達水平較低，而在LS174T、SW480

7、細胞株中則表達水平較高。
　　(2) SLFN11 siRNA有效轉(zhuǎn)染細胞后，與Contol siRNA組相比，SLFN11基因蛋白表達水平減低50-81％。重組表達質(zhì)粒pcDNA3.1-SLFN11測序正確。EXN91 mAb標(biāo)記的AuNP載體可將SLFN11基因?qū)?0％以上的HCT8細胞，遠遠高于Lipofectamine2000載體對SLFN11基因的細胞導(dǎo)入(10％)。而同型對照mAb標(biāo)記的AuNP載體只有極少量的SLF

8、N11基因?qū)?。?jīng)典的Lipofectamine2000載體僅能使HCT-8細胞中SLFN11的蛋白表達水平上調(diào)2.1倍，而EXN91-mAb-AuNP靶向輸送系統(tǒng)則可使HCT-8細胞中SLFN11蛋白表達水平上調(diào)11.9倍。
　　(3)不同濃度SN-38作用腸癌細胞株48h，LS174T和SW480細胞株siRNA干擾組較陰性干擾對照組(mock)，細胞生長抑制率明顯減低(p＜0.01，0.01)。SLFN11低表達的HCT8和

9、HCT116細胞株siRNA干擾組較陰性干擾對照組，細胞生長抑制率無顯著性減低(p＞0.05)。EXN91mAb-AuNP介導(dǎo)的HCT8細胞SLFN11基因表達上調(diào)后，與對照組相比，明顯增強SN-38對細胞增殖的抑制(p＜0.001)。
　　(4)80nM SN-38作用24h，可誘發(fā)腸癌細胞株發(fā)生細胞S期早期阻滯，與不用藥物空白對照組相比， G0/G1期細胞明顯增多，S期細胞明顯減少(p＜0.01)。SN-38干預(yù)LS174T和

10、SW480細胞株中，SLFN11基因siRNA干預(yù)均可以明顯減少細胞周期S早期阻滯的比例:與mock+SN-38組相比:LS174T和SW480細胞株SLFN11siRNA+SN-38組G0/G1期細胞減少(p＜0.05，p＜0.05)S期細胞增多(p＜0.01，p＞0.05)。HCT8細胞株進行EXN91mAb-AuNP介導(dǎo)的SLFN11基因表達上調(diào)后，也出現(xiàn)明顯的G1期阻滯，G0/G1期細胞比例較對同型mAb照組及空白對照明顯升高，

11、S期細胞減少（p均＜0.01）。Lipofectamine2000介導(dǎo)的SLFN11基因表達上調(diào)后，G0/G1期細胞比例輕度升高，但較空白對照組無統(tǒng)計學(xué)差異(p＞0.05)。
　　(5) SN-38可以誘發(fā)腸癌細胞株凋亡（對照+SN-38組vs空白對照組，p＜0.001）。與mock SN-38干預(yù)組相比，SLFN11基因siRNA干預(yù)可以明顯減少LS174T和SW480株用藥組細胞凋亡比例(p＜0.05，p＜0.05)。HCT8

12、細胞株進行EXN91 mAb-AuNP介導(dǎo)的SLFN11基因表達上調(diào)后，與同型mAb-AuNP對照組相比，SN-38誘導(dǎo)的細胞凋亡比例明顯增加(p＜0.01)。Lipofectamine2000-SLFN11組較control組，細胞凋亡也有所增加(p＜0.05)。
　　(6) SLFN11基因能增強SN-38對細胞的作用，在沒有SN-38干預(yù)的條件下，SLFN11基因表達水平對細胞周期和細胞凋亡都無影響(p＞0.05)。

13、　　結(jié)論:
　　(1)在人源性結(jié)直腸癌細胞株中，SLFN11基因表達水平存在明顯差異，在LS174T、SW480細胞株中高表達，在HCT8和HCT116細胞株中低表達。
　　(2) SLFN11基因表達水平影響SN-38對腸癌細胞的作用。我們在腸癌細胞株中證實SLFN11表達下調(diào)會減低細胞對SN-38的敏感性;上調(diào)SLFN11表達可以增強SN-38對腸癌細胞株的生長抑制、細胞周期G1期阻滯和細胞凋亡。
　　(3)我們首