巨噬細(xì)胞內(nèi)Rheb1敲除對(duì)小鼠機(jī)體代謝的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制探討.pdf

1、第一部分 mTOR信號(hào)通路受抑制對(duì)巨噬細(xì)胞極化和炎癥因子分泌的影響
　　目的：巨噬細(xì)胞在受到炎癥信號(hào)、應(yīng)激、代謝物等刺激下會(huì)向促炎性(M1型)或抗炎性（M2型）方向極化，并呈現(xiàn)不同水平的促炎性或抗炎性媒介分泌譜。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白/雷帕霉素機(jī)能靶蛋白(Mammalian/Mechanistic Target of雷帕霉素，mTOR)信號(hào)通路是生長、發(fā)育、代謝、免疫、癌癥等生理活動(dòng)的主要調(diào)控者，本研究旨在探討雷帕霉素作用導(dǎo)致的m

2、TOR信號(hào)通路改變對(duì)脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）、棕櫚酸(Palmitic acid，PA)及油酸(Oleic acid，OA)刺激下巨噬細(xì)胞的M1/M2極化趨勢(shì)及相應(yīng)的炎癥介質(zhì)分泌的影響。
　　方法：將Raw264.7小鼠巨噬細(xì)胞穩(wěn)定株均勻鋪板后，分成以下幾組:①未干預(yù)組;②刺激物單獨(dú)干預(yù)組;③mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素干預(yù)組;④刺激物+雷帕霉素共同干預(yù)組。刺激物分別為LPS、PA和OA，選取最佳干

3、預(yù)物濃度和作用時(shí)間進(jìn)行干預(yù)試驗(yàn)，干預(yù)結(jié)束后收集細(xì)胞提取mRNA，通過qRT-PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞募集、促炎及抗炎相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：①在LPS誘導(dǎo)經(jīng)典的促炎性模型中，與未干預(yù)組相比，LPS刺激顯著提高促炎性因子IL-1β的水平，而雷帕霉素刺激也可促進(jìn)IL-1β的表達(dá)，兩者共同刺激時(shí)對(duì)基因的表達(dá)具有疊加效應(yīng)。②與未干預(yù)組相比，PA單獨(dú)刺激可顯著提高IL-1β水平;雷帕霉素刺激可抑制巨噬細(xì)胞募集相關(guān)基因MCP-1的表達(dá)，同樣兩者

4、共同刺激對(duì)于IL-1β表達(dá)的促進(jìn)和MCP-1表達(dá)的抑制有疊加作用。③與未干預(yù)組相比，OA單獨(dú)刺激可促進(jìn)IL-1β及Mrc1表達(dá);而加用雷帕霉素能顯著抑制OA對(duì)MCP-1的正調(diào)控作用，同樣對(duì)于IL-1β與Mrc1表達(dá)的促進(jìn)有疊加作用。
　　結(jié)論：LPS、PA及OA都能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化，促進(jìn)促炎因子的分泌;mTOR信號(hào)通路抑制也可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1型極化，促進(jìn)促炎性因子分泌，促進(jìn)部分抗炎性介質(zhì)的分泌。
　　第二部分巨噬細(xì)胞

5、特異性敲除Rheb1蛋白對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖小鼠整體代謝水平的影響
　　目的：建立巨噬細(xì)胞Rheb1敲除的小鼠模型，通過高脂喂養(yǎng)建立肥胖小鼠模型，研究巨噬細(xì)胞Rheb1敲除的小鼠對(duì)高脂誘導(dǎo)的肥胖及糖脂代謝的作用。
　　方法：構(gòu)建并通過提取尾尖DNA電泳、分離原代巨噬細(xì)胞行qPCR及Western-Blot等方式鑒定Rheb1巨噬細(xì)胞敲除小鼠模型。將5-6周齡敲除小鼠(KO小鼠，實(shí)驗(yàn)組)與同窩野生型Rheb1flox/flox小鼠

6、（WT小鼠，對(duì)照組）分別進(jìn)行4個(gè)月高脂食物飼養(yǎng)(high-fatdiet, HFD)和普通食物喂養(yǎng)(normal diet,ND)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后檢測(cè)小鼠體重和食物消耗量，通過GTT及ITT檢測(cè)小鼠葡萄糖耐受及胰島素敏感性情況。通過大體和切片HE染色、油紅O染色及免疫熒光等手段觀察肝臟、脂肪及肌肉的形態(tài)學(xué)改變。
　　結(jié)果：①通過尾尖提取DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增及瓊脂糖電泳、提取原代巨噬細(xì)胞mRNA后行qRT-PCR以及提取蛋白行Wester

7、n-Blot試驗(yàn)鑒定Rheb1flox/flox F4/80 CreTg0(KO)與Rheb1flox/flox(WT)兩種基因型。②自第10周齡起，高脂組小鼠的平均體重明顯高于正常喂養(yǎng)組，高脂組兩組小鼠體重比較在第19及20周齡具有顯著差異。③GTT結(jié)果示，高脂10周與同期正常喂養(yǎng)時(shí)WT與KO小鼠的葡萄糖耐量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;而16周后兩組小鼠的葡萄糖耐量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，通過曲線下面積及各血糖監(jiān)測(cè)時(shí)間點(diǎn)的比較得出KO組的葡萄糖耐量更差。④I

8、TT結(jié)果示，高脂喂養(yǎng)10周時(shí)兩組小鼠胰島素敏感性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差;，而在16周后，KO小鼠組的胰島素敏感性遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于WT小鼠。⑤高脂喂養(yǎng)5個(gè)月后，無論是空腹還是喂食狀態(tài)下，KO組小鼠的肝臟較WT組體積明顯偏小，重量明顯減輕，且脂肪肝程度減輕，而同齡正常飲食下兩組小鼠的肝臟重量無明顯差別，油紅O染色及HE染色一致表明KO組肝臟脂肪變性及受損程度減輕;同時(shí)，高脂喂養(yǎng)下KO組脂肪組織血管基質(zhì)層有明顯的炎癥細(xì)胞。而高脂喂養(yǎng)下兩組小鼠的肌肉組織無明顯形態(tài)

9、學(xué)差別。
　　結(jié)論：巨噬細(xì)胞Rheb1蛋白特異性敲除，可延緩肥胖的發(fā)展，在損害葡萄糖耐量的同時(shí)改善高脂喂養(yǎng)下周圍血糖調(diào)節(jié)靶器官的胰島素敏感性，減輕因長期高脂飲食誘發(fā)的胰島素抵抗，該改善作用可能與延緩脂肪肝發(fā)展有關(guān)。
　　第三部分巨噬細(xì)胞特異性敲除Rheb1蛋白對(duì)高脂誘導(dǎo)的脂肪肝的作用
　　目的：探討巨噬細(xì)胞特異性敲除Rheb1蛋白后對(duì)高脂誘導(dǎo)的脂肪肝形成及發(fā)展的作用，以及對(duì)肝臟巨噬細(xì)胞浸潤、促炎/抗炎炎癥譜及糖脂代謝功

10、能的影響。
　　方法：PTT檢測(cè)高脂喂養(yǎng)下WT組與KO組小鼠肝臟糖異生功能的變化。獲取禁食過夜的WT組與KO組小鼠肝臟組織，通過qRT-PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤極化、促炎/抗炎炎癥譜、糖脂代謝相關(guān)酶mRNA水平上的表達(dá)改變。
　　結(jié)果：①PTT結(jié)果示高脂喂養(yǎng)4個(gè)月后，兩組小鼠的丙酮酸耐量整體有差異雖未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)水平，較GTT兩組血糖變化差異明顯減小。②qRT-PCR結(jié)果示KO組小鼠巨噬細(xì)胞浸潤指標(biāo)、M2型抗炎癥指標(biāo)和大部分M

11、1型促炎癥指標(biāo)基因表達(dá)較WT組表達(dá)降低;KO組小鼠肝臟中與肝糖原分解的G-6Pase、與脂質(zhì)合成的ACC及SREBP1基因表達(dá)水平較WT組有顯著下降。
　　結(jié)論：巨噬細(xì)胞Rheb1敲除后可改善高脂誘導(dǎo)肥胖相關(guān)的脂肪肝進(jìn)展，可能與改善肝臟糖脂代謝調(diào)節(jié)功能、減少肝臟巨噬細(xì)胞浸潤及促炎性介質(zhì)的分泌有關(guān)。
　　第四部分巨噬細(xì)胞特異性敲除Rheb1基因?qū)χ窘M織的影響
　　目的：探討巨噬細(xì)胞特異性敲除Rheb1蛋白后對(duì)高脂誘導(dǎo)的

12、肥胖小鼠皮下脂肪、性腺脂肪、內(nèi)臟脂肪及褐色脂肪中的巨噬細(xì)胞浸潤、促炎/抗炎炎癥譜及產(chǎn)熱、褐色化功能的影響。
　　方法：獲取高脂喂養(yǎng)WT組與KO組小鼠皮下脂肪、性腺脂肪、腸系膜間脂肪及褐色脂肪，通過qRT-PCR法檢測(cè)巨噬細(xì)胞浸潤、促炎/抗炎炎癥譜、產(chǎn)熱及褐色化功能mRNA水平上的改變。
　　結(jié)果：①qRT-PCR結(jié)果示高脂喂養(yǎng)時(shí)，KO組小鼠的皮下脂肪組織中大部分M1型炎癥指標(biāo)及部分M2型炎癥指標(biāo)表達(dá)水平較WT組降低;在性腺脂

13、肪組織中，KO組的F4/80表達(dá)下降，各種M1型指標(biāo)表達(dá)變化趨勢(shì)不一，但絕大部分M2型指標(biāo)基因表達(dá)水平上升;在褐色脂肪組織中主要表現(xiàn)為，KO組的F4/80表達(dá)水平顯著提高，大多數(shù)M2型指標(biāo)（IL-4，IL-10，Mrc1，Mgl2），巨噬細(xì)胞浸潤程度改變與性腺脂肪的截然相反，但同時(shí)具有向M2型極化的趨勢(shì);而在腸系膜脂肪組織中的巨噬細(xì)胞浸潤程度及M1/M2型極化趨勢(shì)在WT組與KO組中無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。②皮下脂肪及性腺脂肪組織中表達(dá)CD11c+

14、CD206-標(biāo)記物的細(xì)胞在KO組小鼠中表達(dá)減少，而表達(dá)CD11c-CD206+標(biāo)記物的細(xì)胞比例稍增加，同時(shí)這兩種細(xì)胞群的比值在KO組小鼠中同樣是降低的趨勢(shì)，尤其是在皮下脂肪組織內(nèi)。③較WT組相比，KO組皮下脂肪組織中PAPRγ、Prdm16、UCP1表達(dá)有顯著上升;在性腺脂肪中，除Prdm16外的其他產(chǎn)熱及褐色化基因表達(dá)改變趨勢(shì)同皮下組織;在褐色脂肪組織中，KO組所有待測(cè)基因的表達(dá)水平均顯著高于WT組，尤其是PGC1α、Cidea、PA

15、PRγ、Prdm16和UCP1;腸系膜脂肪組織中僅PAPRγ的表達(dá)改變有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，同時(shí)PAPRγ還是M2型炎癥的一個(gè)指標(biāo)，余產(chǎn)熱及褐色化功能相關(guān)基因改變不顯著。
　　結(jié)論：巨噬細(xì)胞Rheb1敲除后，高脂喂養(yǎng)導(dǎo)致的皮下脂肪組織內(nèi)所浸潤的巨噬細(xì)胞M2型極化與脂肪產(chǎn)熱及褐色化功能增強(qiáng)有正相關(guān)性，而褐色脂肪組織中巨噬細(xì)胞浸潤增加以及M2型極化也與脂肪產(chǎn)熱及褐色化功能增強(qiáng)有正相關(guān)性;性腺脂肪巨噬細(xì)胞浸潤極化與脂肪產(chǎn)熱及褐色