紫外線光催化不同表面形貌純鈦帽植入兔顱骨早期成骨效能初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 骨整合(Osseointgration)理論提出及不斷運用于實踐，為現(xiàn)代口腔種植學的快速發(fā)展奠定堅實的基礎。隨著科學技術和口腔種植體材料學的不斷發(fā)展以及臨床上為了滿足不同患者的不同的需求的基礎上，學者們提出了現(xiàn)代種植學的基本目標是恢復患者正常的咀嚼，言語，健康和美觀等四大功能。為了達到以上的目標，相關研究工作者在前人的基礎上繼續(xù)致力于改善純鈦種植體的表面處理，以期獲得更快速，有效的骨結合性能滿足日益增長的臨床需

2、求。
　　 種植體植入后骨組織愈合模式主要有兩種，接觸成骨和距離成骨:接觸成骨是指成骨細胞在種植體表面接觸后直接分泌骨基質，新生的骨基質直接沉積在種植體表面，其生長方向是由種植體表面向舊骨組織生長;距離成骨與之相反，新生骨基質沉積在種植體附近和周圍的舊骨組織表面，其生長的方向為舊骨組織向種植表面生長。Davies等研究指出這兩種愈合方式揭示骨引導作用及編織骨的形成是骨結合形成中的關鍵步驟，正是由于這些骨基質的形成，種植體得以錨定

3、在種植位點。接觸成骨的最主要的過程是能夠盡早的建立生物學基質（血凝塊），間充質細胞可從中遷移，粘附于種植體表面后，既而增殖和分化成為成骨細胞，最終在種植體表面沉積新的骨基質。盡快建立接觸成骨所需的條件的優(yōu)化，有利于促進骨組織形成。骨組織愈合的速率和程度依賴于種植體表面接觸成骨的程度。Pokharau等研究接觸成骨在種植體表面直接形成的編制骨有利于增加種植體初期和早期的機械穩(wěn)定性。近年來，相關研究熱點關注接觸成骨與可直接發(fā)生在經(jīng)過表面處理

4、的種植材料的表面，其中材料經(jīng)表面處理后是否具有骨引導性能是影響接觸成骨的關鍵因素。
　　 1997年Wang等領導的研究小組，首次使用紫外線對二氧化鈦膜進行表面處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)處理過的二氧化鈦膜層由疏水性能向超親水性能轉變。但Carlsson等體內實驗研究認為具有親水性表面的種植體難以表現(xiàn)出更高的骨結合效能。而Buser等指出親水性種植體與傳統(tǒng)的種植體相比具有更高的骨-種植體接觸率。隨后學者們對紫外線的光催化作用逐漸運用到種植體的表

5、面改性中，以期通過一種非化學性，非生物性的處理方法來提高種植體的表面能，提高純鈦種植體骨引導性能，促進和加快種植體表面接觸成骨的發(fā)生，縮短種植體臨床愈合時間。前期的大量的研究表明經(jīng)過表面處理（如機械表面處理，大顆粒的噴砂酸蝕）純鈦種植體在無菌和密閉的環(huán)境中存儲，隨著存儲時間的增加，碳原子的含量逐漸增加，一方面增大了種植體的體積，另外一方面減少成骨細胞的接觸和蛋白的吸附。近年來，大量的研究發(fā)現(xiàn)，臨床上使用的種植體表面存在的碳氫化合物的污染

6、，種植體表面的生物活性的下降與其表面碳原子的增加兩者之間具有統(tǒng)計學意義上相關性。結合近年來關于表面處理研究技術發(fā)展趨勢，是結合多種表面處理方法，取長補短，發(fā)揮各種處理方法的特點和優(yōu)勢，向綜合性的表面處理方向發(fā)展，其最終目標都是朝著提高種植體的骨引導性能和生物相容性，促進種植體表面直接的骨沉積從而提高種植體結合力。與傳統(tǒng)的表面處理技術相比較，UV作為一種新的處理方法，具有簡單，高效性能，不需要通過增加原種植體表面處理后的形貌或改變表面的化

7、學元素等。本課題組前期通過對噴砂酸蝕的純鈦表面添加紫外線光催化作用的理化實驗和細胞實驗中研究表明，UV處理可以不改變表面的化學形貌和粗糙度情況下，表面獲得大量的親水性基團-OH，MG63成骨細胞體外生物活性檢測在各個時間點1d，7d，14d中，與疏水性的SLA表面相比較，更加促進細胞的粘附，增殖，分化和礦化。在前期研究的基礎上，我們初步預期使用紫外線對純鈦進行表面處理可以提高骨引導性能。本實驗的目的是從動物實驗的角度進一步驗證不同表面形

8、貌（即機械處理表面和噴砂酸蝕表面）經(jīng)紫外線光催化作用的骨引導性能及動物體內早期成骨效能。
　　 目的：
　　 1.對傳統(tǒng)運用純鈦帽進行改良，探討其植入兔顱骨動物模型實驗研究的可行性，以期為種植體表面處理的動物研究提供一種可靠、高效、簡便、重復性良好動物模型。
　　 2.探討紫外線光催化不同表面形貌（即機械處理表面與噴砂酸蝕表面）純鈦帽植入兔顱骨的初期時間段(2w，4w，6w)骨引導性能及成骨效能，為紫外線運用于表

9、面處理方式提供進一步的動物實驗依據(jù)。
　　 材料與方法：
　　 1.材料
　　 健康、成年、雌性新西蘭大白兔18只，由廣東省醫(yī)學動物實驗中心提供。純鈦板Gr2由Titanium Metal Corporation提供。純鈦帽經(jīng)廣州市吉峰金屬塑膠制品有限公司加工制作為中空半球形鈦帽（外徑7.0mm、內徑6.0mm，厚度0.5mm、深度3.0mm），底部添加漸進性自攻性螺紋（螺紋高度2.0mm，牙距0.45mm、牙深

10、0.35mm），項部添加兩個直徑為0.8mm環(huán)形小孔。
　　 2.鈦帽內表面處理方法及分組情況
　　 純鈦帽表面處理方法參照本實驗組前期的研究結果。樣本經(jīng)機械處理后為T組，紫外光處理后為T-UV組。部分實驗樣本經(jīng)120μm Al2O3噴砂后經(jīng)18％HCl和49％ H2SO4混合溶液，60℃酸蝕30 min后，去離子水超聲蕩洗15min，室溫干燥24h，制備SLA組;在此基礎上經(jīng)紫外光處理后制備SLA-UV組。
　　

11、 3.動物模型的建立
　　 18只兔子嚴格按照無菌操作的具體流程進行，在兔子顱骨上制備4個環(huán)形裂隙，植入四個不同表面處理的純鈦帽。術后使用抗生素進行預防感染。處死前的13天、14天在頸部皮下注射四環(huán)素30mg/kg，處死前的3天、4天頸部皮下注射鈣黃綠素6mg/kg.所有動物按照觀察時間點2w，4w，6w分別處死。將每只兔子顱骨上純鈦帽合并顱骨完整取出進行初步修整后放入10％中性福爾馬林溶液中進行固定。
　　 4.制作

12、不脫鈣組織切片及組織學觀察
　　 將獲得的標本按照不同濃度的乙醇進行逐級脫水，氯仿透明，甲基丙烯酸甲酯浸潤及逐級固化后，LEICA SP1600硬組織切片機切割150μm厚度骨磨片，手工磨片至100μm時，移至熒光顯微鏡下觀察。隨后繼續(xù)手工磨片至于30μm，亞甲基藍，酸性品紅染色。光學顯微鏡下觀察新生骨組織的形態(tài)及通過圖像測量軟件獲得相關的檢測指標的實驗數(shù)據(jù)。
　　 5.檢測指標
　　 ①礦化新生骨組織的百分比(

13、mineralized bone，MB％)=新生礦化骨組織的量(the newly mineralized formed bone tissue)/鈦帽內總面積(the total spaces of theinner dome)*100％
　　 ②新生總骨量百分比(newly formed total bone，TB％)=新生骨組織總量(thenewly formed total bone)/鈦帽內總面積(the total

14、spaces of the inner dome)*100％
　　 ③骨組織-鈦帽結合率(bone-implant contact，BIC)=骨組織-鈦帽結合長度(thelength of new trabecular bone in contact with inner surface of dome)/鈦帽內表面長度(the length of the inner dome)*100％
　　 6.統(tǒng)計學分析
　

15、　 運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對實驗獲取的各類檢測指標的數(shù)據(jù)進行歸類，整合及分析。首先用析因方差對不同形貌，不同的處理方式及不同時間段進行初步分析，若存在交互效應后則對各個時間段內進行兩獨立樣本t檢驗的分析。
　　 結果：
　　 1.術后觀察
　　 術后所有的動物恢復良好，術后5天內動物精神狀況疲憊，運動較少，進食減少。1w后所有的動物基本恢復正常。處死后觀察所有的鈦帽均無松動，脫落或移位現(xiàn)象。大體標本觀察純

16、鈦帽周圍大量的纖維軟組織包裹，隨著觀察時間點的不同，纖維組織有增長的趨勢，部分纖維組織沿著純鈦帽上的小孔長入純鈦帽形成的空腔中。
　　 2.熒光顯微鏡觀察:
　　 通過熒光顯微鏡觀察到純鈦帽內新生骨組織，呈現(xiàn)亮綠色。新生骨沿著鈦帽的內側壁向上生長。新生骨組織與舊骨組織之間形成明顯的界限。礦化的骨小梁為亮綠色，與周圍的骨髓腔，軟組織形成鮮明的對比。2w時，各組內新生少量薄層的骨組織沉積顱骨表面。T組內新生骨與鈦帽無直接接觸

17、，T-UV組與SLA-UV組分別較T組與SLA組多，且骨組織直接接觸鈦帽。4w時，各組鈦帽內新生骨量進一步增加，部分軟組織長入鈦帽內部。其中SLA-UV組新生骨組織最多，T-UV組與SLA-UV組內見新生骨組織沿著鈦帽內側部向上生長，礦化骨小梁緊貼鈦帽內側壁生長，部分甚至到達鈦帽上1/3。6w時，各個鈦帽內新生骨量生長速度較慢，SLA-UV組與SLA組熒光顯示的新生骨量差別不大，T-UV組內新生骨量較T組內多。
　　 3.光學顯

18、微鏡觀察:
　　 亞甲基藍-酸性品紅染色后在光學顯微鏡下可觀察到，礦化成熟的骨小梁染色為深紅色，類骨質，纖維組織為藍色。隨著觀察時間點的延長，各組內新生骨組織逐漸增加，在2w到4w期間，新生骨組織生長速度較快。在4w到6w期間骨組織生長速度較緩慢。2w時，各組之間僅有少量的礦化的骨小梁生成，骨小梁薄梭形，條索狀多見;與T相比，T-UV組，SLA-UV組與SLA組可見礦化小梁直接與鈦帽的內側壁接觸。4w時，各組之間的新生骨組織進一

19、步增加，骨小梁形態(tài)逐漸變粗，呈現(xiàn)出進行性礦化。部分軟組織長入鈦帽內部。新生骨小梁錨定在顱骨表面，除T組外，其余的三組新生骨小梁與鈦帽內側壁緊密接觸，但是在各組接觸的高度不同。T-UV組與SLA-UV新生骨組織與鈦帽內側接觸及生長高度最明顯，幾乎到達頂部1/3。6w時，軟組織繼續(xù)生長占據(jù)一定的空間，新生骨組織生長空間受限。骨小梁逐漸礦化沉積加粗，相互連接成網(wǎng)狀和片狀，T-UV組及SLA-UV組新生骨組織及鈦帽與礦化骨小梁接觸均高于T組于與

20、SLA組。
　　 4.統(tǒng)計分析結果
　　 經(jīng)過析因分析結果發(fā)現(xiàn)不同的表面形貌，不同的時間點，不同的處理因素之間各個觀測指標存在差異，采用兩獨立樣本t檢驗。具體結果如下:
　　 2w時，各組的礦化新生骨組織占整個鈦帽總面積的百分比的均數(shù)如下:T-UV組(3.800±1.640)％＞T組(2.350±1.411)％，SLA-UV組(6.178±3.989)％＞SLA組(4.239±1.812)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，

21、均未達到統(tǒng)計學上的差異。各組新生總骨量占整個鈦帽總面積百分比均數(shù)如下:T-UV組(16.363±8.7590)％＞T組(10.062±7.057)％，SLA-UV組(22.625±16.417)％＞SLA組(17.627±7.933)％，各組經(jīng)t檢驗后，均未達到統(tǒng)計學上的差異。各組新生骨組織-鈦帽接觸率的均數(shù)如下:T-UV組(6.622±1.297)％＞T組(4.208±2.228)％， SLA-UV組(17.003±7.552)％＞S

22、LA組(8.653±2.813)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，前者(P=0.048＜0.05)與后者(P=0.029＜0.05)均達到統(tǒng)計學上的差異。
　　 4w時，各組的礦化新生骨組織占整個鈦帽總面積的百分比的均數(shù)如下:T-UV組(12.596±5.028)％＞T組(9.590±5.317)％,SLA-UV組(16.825±6.892)％＞SLA組(9.899±3.729)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，均未達到統(tǒng)計學上的差異。各組新生總骨

23、量占整個鈦帽總面積百分比均數(shù)如下:T-UV組(44.714±13.803)％＞T組(32.975±15.619)％,SLA-UV組(59.006±23.990)％＞SLA組(33.115±12.111)％,各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，前者未達到統(tǒng)計學上差異，后者達到統(tǒng)計學上的差異(P=0.048＜0.05)。各組新生骨組織-鈦帽接觸率的均數(shù)如下:T-UV組(30.850±13.741)％＞T組(15.168±6.648)％,SLA-UV組(43

24、.144±13.352)％＞SLA組(23.634±15.321)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，P值分別為(P=0.039＜0.05)與(P=0.041＜0.05)，兩者均達統(tǒng)計學上差異。
　　 6w時，各組的礦化新生骨組織占整個鈦帽總面積的百分比的均數(shù)如下:T-UV組(13.956±3.740)％＞T組(10.094±2.470)％,SLA-UV組(17.087±3.097)％＞SLA組(13.021±2.639)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢

25、驗后，兩者均未達到統(tǒng)計學上的差異。各組新生總骨量占整個鈦帽總面積百分比均數(shù)如下:T-UV組(45.353±16.423)％＞T組(33.057±4.300)％,SLA-UV組(63.556±19.870)％＞SLA組(55.296±15.819)％，各組數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗后，前者(P=0.031＜0.05)達到統(tǒng)計學上差異，后者未達到統(tǒng)計學上的差異。各組新生骨組織-鈦帽接觸率的均數(shù)如下:T-UV組(25.805±8.332)％＞T組(16.1

26、67±2.879)％,SLA-UV組(53.961±14.257)％＞SLA組(35.778±9.819)％，各組經(jīng)t檢驗后，前者(P=0.036＜0.05)與后者均達統(tǒng)計學上差異(P=0.030＜0.05)。
　　 結論：
　　 1.改良自攻性純鈦帽制作加工相對傳統(tǒng)的鈦帽工藝簡單，重復性良好，加工成品規(guī)格形變小。自攻性螺紋增加鈦帽穩(wěn)定性，減少輔助固定裝置。改良自攻性純鈦帽在兔顱骨動物實驗模型中的運用，減少手術創(chuàng)傷，簡化

27、操作步驟，提高實驗效率，更加客觀可靠反映植入物生物相容性。改良自攻性純鈦帽是種植體表面處理方式的一種具有應用前景的動物實驗模型。
　　 2.不同形貌的純鈦帽表面經(jīng)紫外線光催化后植入兔顱骨，表現(xiàn)出良好的生物相容性和骨引導性能;T-UV組，SLA-UV組骨引導性能分別優(yōu)于T組，SLA組。機械處理表面和噴砂酸蝕表面復合UV光催化作用能夠顯著提高純鈦表面的骨引導性能，促進鈦-骨組織界面上新生骨組織的直接沉積，礦化，加速接觸成骨過程。