腦攝取平衡時(shí)丙泊酚對犬腦不同區(qū)域興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT2 mRNA的影響.pdf

1、靜脈全麻藥物丙泊酚因具有起效快、持續(xù)時(shí)間短、代謝迅速、術(shù)后惡心嘔吐發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于臨床麻醉的誘導(dǎo)、維持以及重癥病人的鎮(zhèn)靜，但其中樞作用機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和傳遞在全麻藥物作用機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。因此，進(jìn)一步探討丙泊酚對不同腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的影響有助于揭示其中樞作用機(jī)制。
　　 谷氨酸(glutamate acid)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與痛覺傳導(dǎo)

2、、中樞過敏、學(xué)習(xí)記憶、神經(jīng)生長等重要的生物學(xué)效應(yīng)。它是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量最多的興奮性遞質(zhì)，一旦發(fā)生調(diào)節(jié)障礙就可能會導(dǎo)致神經(jīng)毒性。星形膠質(zhì)細(xì)胞攝取谷氨酸能夠終止谷氨酸能神經(jīng)傳遞，以防止胞外谷氨酸濃度過高對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生毒性，但叔丁基過氧化氫能夠抑制機(jī)體的這種保護(hù)機(jī)制。應(yīng)用丙泊酚可以防止和逆轉(zhuǎn)叔丁基過氧化氫對星形膠質(zhì)細(xì)胞的影響，這或許可以避免突觸外谷氨酸病理性增加，從而延緩或阻止興奮性神經(jīng)元的死亡。然而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞外的谷氨酸代謝酶系統(tǒng)對谷

3、氨酸含量影響甚微，突觸間隙谷氨酸濃度的調(diào)節(jié)主要依賴于谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體分高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體，即興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（EAATs）和低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)體，即囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(VGLUTs)兩種類型，目前已知的位于細(xì)胞膜的EAATs有5種，其中主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)的興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2(EAAT2，在嚙齒類動物又稱為GLT-1)能逆濃度梯度從胞外向胞內(nèi)攝取谷氨酸，中止谷氨酸能神經(jīng)遞質(zhì)傳遞，與腦中大部分谷氨酸的攝取密切相關(guān)。病理狀態(tài)下星形膠質(zhì)

4、細(xì)胞上EAAT2功能及表達(dá)會發(fā)生異常，這將導(dǎo)致細(xì)胞外谷氨酸異常堆積，許多神經(jīng)系統(tǒng)的疾病可能與此密切相關(guān)。SD大鼠鞘內(nèi)注射EAAT2選擇性抑制劑DHK能夠增加異氟醚的MAC值。臨床濃度下的異氟醚(1％～3％)還能以時(shí)間、鈉離子和濃度依賴的方式增強(qiáng)原代培養(yǎng)大鼠腦神經(jīng)元中GLAST和GLT-1的最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率(Vmax)及配體親和力（Km）。濃度在1～1000μmol之間的局部麻醉藥利多卡因和布比卡因均不改變谷氨酸誘導(dǎo)出的內(nèi)向電流，而濃度為0.

5、3～300μmol的靜脈麻醉藥硫噴妥鈉和氯胺酮對GLT-1轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響也十分微弱。但在缺血缺氧狀態(tài)下，GLT-1能夠逆向轉(zhuǎn)運(yùn)谷氨酸，此時(shí)咪唑安定和氯胺酮可以發(fā)揮腦保護(hù)作用，減弱其逆向轉(zhuǎn)運(yùn)作用，但未發(fā)現(xiàn)硫噴妥鈉和丙泊酚具有這種保護(hù)作用。臨床濃度下的丙泊酚和非特異性NMDA受體拮抗劑MK-801對細(xì)胞的缺血保護(hù)作用相當(dāng)，但不能被GLT-1拮抗劑阻斷。這表明，丙泊酚的缺血保護(hù)作用不是通過谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體發(fā)揮作用的。研究發(fā)現(xiàn)，GLT-1的表達(dá)對縫

6、隙連接具有依賴性，而丙泊酚作為縫隙連接阻斷劑能夠抑制GLT-1的表達(dá)。這些結(jié)論表明，多種麻醉藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)狀態(tài)的影響均與EAAT2密切相關(guān)。
　　 丙泊酚的全麻作用可能與某些特殊區(qū)域腦組織有關(guān)。我們前期研究表明，腦攝取平衡時(shí)，丙泊酚在犬腦不同區(qū)域呈均衡分布，不同麻醉深度的丙泊酚可影響犬腦不同腦區(qū)谷氨酸的表達(dá):深麻醉狀態(tài)下各腦區(qū)谷氨酸濃度較淺麻醉狀態(tài)明顯降低，其中下丘腦谷氨酸變化率明顯高于其他腦組織。
　　 本研究采用

7、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)技術(shù)，進(jìn)一步觀察不同麻醉深度丙泊酚恒速輸注50min腦攝取平衡時(shí)，丙泊酚對犬腦各區(qū)域（下丘腦、底丘腦、背側(cè)丘腦、海馬、腦橋、項(xiàng)葉以及額葉）EAAT2 mRNA的影響，以探討不同麻醉深度丙泊酚對不同腦區(qū)興奮性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的中樞作用。
　　 材料和方法：
　　 1動物準(zhǔn)備與分組
　　 18只健康雜種犬，雌雄不限，年齡12～18個月，體重10～12kg，由南方醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中

8、心提供。隨機(jī)分為對照組（C組）、低劑量組（L組）和高劑量組（H組），每組6只。實(shí)驗(yàn)均安排在上午8:00至12:00進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)前禁食、水12小時(shí)，經(jīng)右后肢大隱靜脈開放外周靜脈通路。
　　 2麻醉管理
　　 C組:經(jīng)右后肢大隱靜脈快速推注10％KCl2mg/kg處死。
　　 L組:誘導(dǎo)時(shí)經(jīng)右后肢大隱靜脈注入丙泊酚5.5mg/kg，注射時(shí)間為15s。續(xù)以55mg/kg/h恒速靜脈輸注丙泊酚50min維持麻醉。
　

9、　 H組:誘導(dǎo)時(shí)經(jīng)右后肢大隱靜脈注入丙泊酚7.0mg/kg，注射時(shí)間為15s。續(xù)以70mg/kg/h恒速靜脈輸注丙泊酚50min維持麻醉。
　　 待兩組動物達(dá)到預(yù)定麻醉深度（眼瞼反射及踏板反射消失）后，經(jīng)口插入ID9.0號氣管導(dǎo)管，固定并連接呼吸機(jī)，吸入純氧，調(diào)節(jié)呼吸頻率每分鐘15～20次，潮氣量15ml/kg，使呼氣末二氧化碳分壓(PETCO2)維持在30～38mmHg，犬尾尖端接指套監(jiān)測SpO2，使SPO2＞95％。以20

10、G肝素化套管針行右股動脈穿刺，接BeneView T8多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀檢測平均動脈壓(MAP)和脈率(PR)。
　　 3標(biāo)本采集
　　 丙泊酚恒速輸注50min時(shí)，兩組分別取頸內(nèi)動、靜脈血各2ml，注入含枸櫞酸鉀抗凝液的真空采血管內(nèi)，充分混勻，-4℃冰箱中保存。兩組均靜脈推注10％的KCl注射液2mg/kg處死動物，無菌條件下分離并獲取下丘腦、底丘腦、背側(cè)丘腦、海馬、腦橋、頂葉以及額葉組織(0.15～0.3g)，剔除血管與軟

11、腦膜，用蒸餾水沖洗血跡，置于無菌干燥EP管中，于-80℃超低溫冰箱中保存待檢。
　　 4血漿丙泊酚濃度測定
　　 抗凝的血樣品于4℃下以3500r/min離心10min分離血漿。取血漿200μl于EP管，加入乙腈400μl用渦旋器震蕩2min，10000r/min再離心10min，取上清液20μl。以高效液相色譜-紫外法(HPLC-UV)測量血漿丙泊酚濃度。
　　 高效液相色譜條件:色譜柱（Shim-pack V

12、P-ODS，250nm×4.6mmID），保護(hù)柱(Shim-pack GVP-ODS，10mm×4.6mmID)，流動相A為純水，流動相B為甲醇，A∶B為15∶85，自動進(jìn)樣量20μl，柱溫:4℃，流速1ml/min，檢測波長270nm。所用試劑為分析純。
　　 5腦區(qū)篩選
　　 在選擇待測指標(biāo)時(shí)采用混合樣品檢測法(PDT)，即將同組的6只實(shí)驗(yàn)犬取同一腦區(qū)的的腦組織等質(zhì)量混和，總量0.1g。3組動物7個腦區(qū)共得到21個混

13、合組織標(biāo)本，應(yīng)用qRT-PCR檢測混合樣本中EAAT2 mRNA的表達(dá)水平，篩選出組間表達(dá)差異顯著（差異倍數(shù)＞2）的腦區(qū)做進(jìn)一步的檢測。
　　 6腦組織EAAT2 mRNA含量測定
　　 采用qRT-PCR方法檢測各腦區(qū)EAAT2 mRNA的表達(dá)水平。
　　 6.1總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄
　　 Trizol法提取各組總RNA后按照Takara公司RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(RT)，反應(yīng)體系:5×Bu

14、ffer2μl，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，dNTP0.5μl，隨機(jī)引物1μl，DEPC水4.5μl，RNA1μl，共10μl。RT反應(yīng)條件為42℃30min，100℃3min，反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物cDNA置-20℃保存。
　　 6.2 qRT-PCR檢測
　　 根據(jù)GenBank提供的EAAT2基因序列(NC_006600)和mRNA設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier5.0設(shè)計(jì)引物并交由英濰

15、捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。qRT-PCR檢測采用SYBR Green I染料法，反應(yīng)體系如下:總體積25μl，其中含SYBR Green PCR Master Mix12.5μl，目的基因上游引物0.5μl，目的基因下游引物0.5μl，DEPC水10.5μl，cDNA模板1μl。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min;95℃10s，60℃30s，共40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解曲線分析。所有反應(yīng)重復(fù)均3次。
　　 6.3數(shù)據(jù)處理<

16、br>　　 以2-△△CT值表示L組和H組基因的相對表達(dá)量，△CT=CT待測基因-CT內(nèi)參基因，△△CT=△CT實(shí)驗(yàn)組（L組或H組）-△CT對照組（C組）。
　　 7統(tǒng)計(jì)方法
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。L組、H組頸內(nèi)動、靜脈間血漿丙泊酚濃度比較采用配對t檢驗(yàn)，兩組之間頸內(nèi)動脈丙泊酚血漿濃度的比較及頸內(nèi)靜脈丙泊酚血漿濃度的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。三組間同一腦區(qū)EAAT2 m

17、RNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析，滿足方差齊性的多重比較采用LSD法，不滿足方差齊性的多重比較采用Tambane's法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1一般情況
　　 三組實(shí)驗(yàn)犬年齡、體重、性別均無顯著性差異，L組和H組實(shí)驗(yàn)動物均安全迅速達(dá)到預(yù)定麻醉狀態(tài)并維持穩(wěn)定，無嗆咳、嘔吐等不良反應(yīng)，平均動脈壓和脈搏在犬正常生理值范圍內(nèi)波動。L組MAP(77.00±6.90)mmHg，PR(11

18、5.50±5.17)次/min，H組MAP（54.17±5.98）mmHg，PR（89.00±4.10）次/min，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 2犬頸內(nèi)動、靜脈丙泊酚血漿濃度
　　 L組頸內(nèi)動、靜脈血漿丙泊酚濃度分別為3.18±0.06μg/ml和3.12±0.09μg/ml，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);H組頸內(nèi)動、靜脈血漿丙泊酚濃度分別為6.21±0.07μg/ml和6.14±0.11μg/m

19、l，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。兩組之間丙泊酚血漿濃度（動脈-動脈，靜脈-靜脈比較），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　 3 qRT-PCR產(chǎn)物的特異性檢驗(yàn)
　　 qRT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線分析結(jié)果顯示為單一尖銳峰，無引物二聚體，擴(kuò)增效率大于95％。
　　 4腦區(qū)篩選
　　 與C組比較，在下丘腦、海馬、頂葉和背側(cè)丘腦四個腦區(qū)L組和H組的EAAT2rnRNA表達(dá)差異顯著且一致性較好，其余腦

20、區(qū)差異不明顯。
　　 5 EAAT2 mRNA相對表達(dá)量
　　 下丘腦L組和H組EAAT2 mRNA的相對表達(dá)量分別為C組的（2.14±0.69）和(2.04±0.73)倍;
　　 海馬L組和H組EAAT2 mRNA的相對表達(dá)量分別為C組的（1.83±0.58）倍和(2.42±0.87)倍;
　　 頂葉L組和H組EAAT2 mRNA的相對表達(dá)量分別為C組的（1.60±0.41）和(1.59±0.23)倍。

21、
　　 下丘腦、海馬以及頂葉的L組、H組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但L組和H組之間比較無明顯差異(P＞0.05)。
　　 背側(cè)丘腦EAAT2 mRNA的相對表達(dá)量三組之間比較均無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.丙泊酚恒速靜脈輸注50min時(shí)，犬腦對丙泊酚的攝取達(dá)到平衡狀態(tài)。
　　 2.腦攝取平衡時(shí)丙泊酚可顯著上調(diào)下丘腦、海馬和頂葉EAAT2 mRNA的表達(dá)，但