多靶點抗血管新生肽ES2-AF的透明質(zhì)酸化修飾及修飾物的生物活性、靶向性及藥代動力學研究.pdf

1、內(nèi)皮抑素(Endostatin，ES)是一個分子量為20 kDa的多肽，最早是從小鼠血管內(nèi)皮瘤中分離出來的，成為首個被發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性抑制血管新生的細胞外基質(zhì)片段，同時也是被研究最多的內(nèi)源性血管新生抑制劑。ES中有一段可高效抑制內(nèi)皮細胞增殖、遷移的序列ES2（60-70，IVRRADRAAVP），其體內(nèi)抑制新生血管生成的活性約為完整ES序列的3倍。
　　Anti-flt1肽(GNQWFI，AF)是從位置掃描合成肽組合文庫中通過一個包含

2、純化的重組VEGF及嵌合受體的掃描系統(tǒng)遴選出來的一種VEGFR1選擇性的六肽。AF肽可特異地與VEGFR1結(jié)合，從而抑制VEGFR1與一系列配體，如VEGFA、VEGFB、PIGF等的相互作用。與其他VEGFR1的單克隆抗體或RNA拮抗劑不同，AF肽是一種能夠通過較低生產(chǎn)成本簡易合成的非免疫原性的六肽，這些優(yōu)點決定了其適合在臨床應用，但是存在水溶性較差的缺點。
　　透明質(zhì)酸(Hyaluronic acid，HA)是一種從牛眼玻璃體

3、中發(fā)現(xiàn)的、帶負電荷的、非硫酸化的線性糖胺聚糖，重復二糖單元為β-N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸，其生物可降解和高載藥性的特點使其廣泛應用于醫(yī)藥領域。HA可通過與細胞及細胞間質(zhì)的受體作用調(diào)節(jié)腫瘤細胞侵襲、腫瘤細胞的分化、成纖維細胞中病毒的轉(zhuǎn)化、胚胎組織形成等過程。有四種HA特定受體存在于細胞膜表面——CD44、RHAMM(Receptor for HA-Mediated Motility)、IVd4和LEC，這之中在腫瘤部位表達較多的

4、是CD44。
　　AF和ES2在活性方面既有相似又有不同，如果將這兩個肽的序列融合在同一個肽中，有望獲得更好的生物活性、更好的穩(wěn)定性和更長的半衰期。為此，我們設計了序列為IVRRADRAAVPGGGGGGNQWFI的肽鏈，將其命名為ES2-AF，并利用可以靶向腫瘤部位高表達的CD44受體的HA對其進行化學修飾，期待修飾后的多肽溶解性更好、靶向性更強、半衰期更長，從而更好的在體內(nèi)更好的發(fā)揮抗新生血管生成作用。本課題研究內(nèi)容和取得的主

5、要成果如下:
　　1.ES2-AF的合成與表征
　　采用Fmoc固相合成方法合成了一種ES2-1inker(GGGG)-AF肽，由高效液相色譜進行純化，純度均可達95％以上，并進行了結(jié)構(gòu)的確證。
　　2.HA-ES2-AF的合成與表征
　　由于HA溶于水但不溶于有機溶劑，為了下一步的偶聯(lián)反應，首先用四丁基氫氧化銨對其進行離子交換，形成可溶于DMSO的HA-TBA結(jié)合物。HA-TBA分子經(jīng)卡特縮合劑(BOP)活化羧

6、基后，與ES2-AF、DIPEA（N，N-二異丙基乙胺）反應得到HA-ES2-AF結(jié)合物。經(jīng)1H NMR核磁結(jié)果分析表明ES2-AF成功被HA修飾，連接率93.75％，平均每HA鏈上連結(jié)60個ES2-AF肽。
　　3.ES2-AF與HA-ES2-AF的生物活性研究
　　3.1.ES2-AF及HA-ES2-AF的體外抗新生血管生成活性研究
　　(1)采用MTT法評價了抗內(nèi)皮細胞增殖作用，ES2與ES2-AF在體外均具有抑

7、制內(nèi)皮細胞增殖的作用，并呈現(xiàn)隨濃度增加的趨勢。當ES2-AF濃度分別為5μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL時，其對內(nèi)皮細胞增殖的抑制率分別為(11.37％±6.09％)、(13.63％±4.92％)、(17.61％±5.59％)、（16.74％±4.57％）、（27.49％±5.56％）。經(jīng)HA修飾后的結(jié)合物HA-ES2-AF也在體外表現(xiàn)出了一定的抑制內(nèi)皮細胞增殖的作用，當其肽濃度分別為表5

8、μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、500μg/mL時，其對內(nèi)皮細胞增殖的抑制率分別為（6.67％±4.92％）、(12.01％±8.13％)、（16.96％±5.23％）、（24.37％±8.97％）、(36.40％±7.65％)。
　　(2)采用Transwell小室法測定了抑制內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移的作用。以PBS作為空白對照，當藥物肽濃度均為200μg/mL時，AF、ES2與ES2-AF三組發(fā)生細胞轉(zhuǎn)移的

9、個數(shù)分別為（229±11）、（254±4）、（255±13）。AF、ES2與ES2-AF三組藥物對于內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移都有一定的抑制作用，但是差異不大，說明三組實驗藥物對于腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制作用并沒有很大差異。當肽濃度均為200μg/mL時，ES2-AF、HA&ES2-AF混合物、HA-ES2-AF結(jié)合物三組發(fā)生細胞轉(zhuǎn)移的個數(shù)分別為（255±13）、（202±24）、（170±7），HA-ES2-AF表現(xiàn)出了最強的抑制內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)移的作用，具體機制

10、仍有待進一步研究。
　　(3)利用管腔形成實驗研究了ES2-AF、HA-ES2-AF等對內(nèi)皮細胞EAhy926形成血管的影響。用PBS作為空白對照，AF與ES2在各濃度時抑制體外內(nèi)皮細胞管腔形成的作用相差不大，但ES2-AF對于內(nèi)皮細胞管腔的形成的抑制作用明顯高于AF和ES2。在肽濃度均為25μg/mL、100μg/mL、200μg/mL時，AF組的節(jié)點數(shù)分別為(99士19)、(75±17)、(63±12)，ES2組的節(jié)點數(shù)分別為

11、（67±14）、（72±3）、（61±5），HA-ES2-AF組的節(jié)點數(shù)分別為(32±3)、（17±6）、(19±5)。由此可見，HA-ES2-AF對內(nèi)皮細胞管腔形成的抑制作用在所有給藥組中是最強的，說明利用HA對多肽的化學修飾提高了其抑制內(nèi)皮細胞官腔形成的能力。
　　(4)采用ELISA方法根據(jù)抗原抗體結(jié)合原理測定了AF、ES2、ES2-AF及HA-ES2-AF對于VEGF及其受體VEGFR1(Flt-1)結(jié)合的抑制能力。ES2

12、與ES2-AF均表現(xiàn)出比AF更強的抑制能力，其中ES2-AF的抑制作用略強于ES2。HA-ES2-AF在5μg/mL～200μg/mL范圍內(nèi)的相對值分別為（83.24％士0％）、（55.01％±0.07％）、（51.04％±0.09％）、（41.25％±0.01％）、（37.76％士0.03％），說明HA-ES2-AF對VEGF及其受體VEGFR1(Flt-1)結(jié)合的抑制能力呈濃度依賴性提高。較高濃度時HA-ES2-AF抑制VEGF及其

13、受體VEGFR1（Flt-1）結(jié)合的能力明顯高于ES2-AF肽。
　　3.2.ES2-AF及HA-ES2-AF的體內(nèi)抗新生血管生成活性研究
　　在雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗中，與生理鹽水組進行相比，AF在實驗劑量下對CAM血管生成沒有明顯抑制作用;ES2-AF組在5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL時新生血管面積百分比分別為（32.03％±0.10％）、（22.84％±0.19％）、（19.26％±0.03％），表

14、現(xiàn)出比ES2更高的體內(nèi)抗血管生成的生物活性并呈現(xiàn)劑量相關。HA與ES2-AF混合物中HA的加入并沒有對ES2-AF在動物體內(nèi)的抑制CAM血管生成產(chǎn)生較大影響。而HA-ES2-AF組在5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL時新生血管面積百分比分別為（9.67％±0.03％）、（10.12％±0.01％）、（13.10％±0.04％），與ES2-AF及混合物組相比抑制CAM血管生成的活性明顯提高。
　　4.HA-ES2-AF的靶

15、向能力研究
　　4.1.體外與CD44受體結(jié)合能力研究
　　通過表面等離子共振(SPR)技術(shù)研究了HA-ES2-AF在體外對腫瘤細胞表面受體CD44的結(jié)合能力。以HA為陽性對照，研究了HA-ES2-AF、ES2-AF與CD44蛋白之間的相互作用關系。篩選合適的pH將CD44蛋白錨定于CM5芯片表面，使樣品流過芯片，通過Biacore T200的分析軟件得出以下三種樣品與CD44蛋白結(jié)合的KD值:HA為4.198×10l1 m

16、ol/L，HA-ES2-AF為4.779×1010 mol/L，ES2-AF為3.011×10-4 mol/L，即樣品與CD44結(jié)合能力的排列順序為:HA＞HA-ES2-AF》ES2-AF，經(jīng)過HA的修飾HA-ES2-AF結(jié)合物對細胞表面受體CD44的結(jié)合能力較修飾前的肽有十分顯著的提升，具有潛在的體內(nèi)腫瘤部位靶向能力。
　　4.2.體內(nèi)組織分布研究
　　通過活體成像技術(shù)研究了HA-ES2-AF在體內(nèi)組織分布情況。將ES2-

17、AF與HA-ES2-AF用FITC標記，分別給藥于荷黑色素瘤裸鼠，采用小動物活體成像儀進行拍照記錄。通過比較發(fā)現(xiàn)HA-ES2-AF-FTIC在裸鼠體內(nèi)分布代謝時間較長，即HA-ES2-AF-FITC的體內(nèi)血漿半衰期較長，證明了化學修飾有助于增強多肽的穩(wěn)定性，這與后面藥代動力學實驗的結(jié)果一致;分布于腫瘤部位的藥物增多，表明經(jīng)HA修飾的ES2-AF-FITC在荷瘤裸鼠體內(nèi)對于腫瘤部位有一定的靶向性，證明了糖基化修飾有助于提高多肽的靶向分布能

18、力，這與SPR實驗的結(jié)果相符合。
　　5.HA-ES2-AF的藥代動力學研究
　　本實驗選用Wistar大鼠作為體內(nèi)藥物代謝動力學的模型，通過比較藥代動力學參數(shù)發(fā)現(xiàn)，與ES2-AF相比，HA-ES2-AF在大鼠體內(nèi)的循環(huán)時間明顯延長，半衰期由2.79 h延長至18.07 h，平均滯留時間MRT由4.68 h增加至13.18 h，藥時曲線下面積AUC0-∞也由2887.80 mg/L·h增大至10694.70 mg/L·h，血

19、漿清除率CL也有所下降。較長時間的維持高血藥水平有助于減少給藥劑量或降低給藥頻率。
　　本研究取得的成果和結(jié)論主要有:
　　(1)成功固相合成了純度在95％以上的ES2-AF肽，其體內(nèi)外抗新生血管生成活性高于ES2或AF。
　　(2)成功完成HA對ES2-AF的化學修飾及結(jié)構(gòu)表征，平均每HA鏈上連結(jié)60個ES2-AF肽。
　　(3) HA-ES2-AF表現(xiàn)出比ES2-AF和HA&ES2-AF混合物更強的抑制內(nèi)皮細