二苯并環(huán)辛二烯類化合物DC9體外抗HBV作用研究.pdf

1、目的:
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)告，乙型肝炎是威脅全人類健康的一種嚴(yán)重的傳染性疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)2017年全球大約有2.57億HBV(Hepatitis BVirus)s抗原陽性者，由感染引起的肝硬化、肝癌及其他相關(guān)性疾病導(dǎo)致的死亡人數(shù)達(dá)88.7萬。目前，用于治療慢性乙型肝炎的方法主要有四種，分別是基因治療、免疫治療、抗病毒治療及保肝治療。在諸多的治療方法中，抗病毒治療仍然是重中

2、之重。現(xiàn)在，臨床用于乙肝治療的藥物主要包括干擾素、核苷（酸）類似物、非核苷類藥物以及中草藥等，但這些藥物長期應(yīng)用會(huì)出現(xiàn)較嚴(yán)重的毒副作用或產(chǎn)生耐藥，且價(jià)格昂貴。另外雖然聯(lián)合用藥比單一用藥更能降低HBV感染者的發(fā)病率和死亡率，但長期聯(lián)合用藥導(dǎo)致的多藥耐藥等問題的出現(xiàn)，更加限制了抗HBV藥物的使用，給臨床工作者帶來了更加巨大的挑戰(zhàn)。因此，不斷探索開發(fā)安全、有效的新型抗HBV藥物是醫(yī)藥研究者當(dāng)務(wù)之急的工作。
　　從天然資源中尋找新的抗HB

3、V藥物或者先導(dǎo)化合物的研究是國內(nèi)外新藥研制中比較活躍的領(lǐng)域之一，也是創(chuàng)制新藥的一種捷徑。二苯并環(huán)辛二烯類(Dibenzo cyclooctadiene，DC)化合物是從五味子科植物中提取出來的一類具有鎮(zhèn)咳、抗腫瘤、抗HBV等生物活性的化合物。DC系列10個(gè)化合物是對(duì)二苯并環(huán)辛二烯進(jìn)行結(jié)構(gòu)改造的一系列化合物，目的是使其能夠更好地發(fā)揮抗HBV效果，為臨床慢性乙型肝炎的治療提供幫助。本論文的研究目的是從DC系列中篩選出具有抗病毒活性的化合物，

4、然后對(duì)活性化合物的抗HBV機(jī)制進(jìn)行初步研究，以期為其進(jìn)一步能夠應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　本課題采用HBV基因轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2.2.15細(xì)胞為篩選模型，以HBsAg和HBeAg為指標(biāo)對(duì)DC系列10個(gè)化合物進(jìn)行體外抗HBV活性篩選，對(duì)篩選出有抗HBV活性的化合物，進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)細(xì)胞上清液及細(xì)胞內(nèi)HBVDNA拷貝數(shù)的影響，并初步研究其作用機(jī)制。其內(nèi)容如下:
　　通過甲基偶氮唑鹽比色分析法(MTT)檢測(cè)

5、化合物對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞的毒性，計(jì)算細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度(TC50);酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)用藥物作用于細(xì)胞6天后的細(xì)胞上清液中的HBsAg、HBeAg的變化，計(jì)算藥物對(duì)抗原分泌的的半數(shù)抑制濃度(IC50);以治療指數(shù)(Therapy Inedx，TI)為指標(biāo)，其中TI=TC50/IC50，評(píng)價(jià)10種受試物的體外抗HBV活性，由此確定DC9為活性化合物。

6、
　　通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(Quantitative Real-time PCR,FQ-PCR)檢測(cè)DC9作用于細(xì)胞3、6、9天后，化合物對(duì)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清中HBV DNA拷貝數(shù)的影響，計(jì)算出DC9對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中及細(xì)胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)的抑制率，根據(jù)與陽性藥物的比較，判斷其體外抗HBV效果。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法(Reverse Tanscription PCR，RT-PCR)檢測(cè)DC9對(duì)Hep

7、G2.2.15細(xì)胞HBV聚合酶(Polymerase，P)基因mRNA表達(dá)活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1:通過篩選，有2種受試藥物對(duì)HBV HBsAg的TI＞1，對(duì)HBeAg的TI＞1只有DC9，確定DC9為活性化合物。
　　2:DC9在體外對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞毒性偏小，其TC50＞400μM;對(duì)HBsAg和HBeAg分泌的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為54.49和28.17μM，治療指數(shù)(TI)分別為＞7.3

8、4和＞14.2;對(duì)細(xì)胞上清液中和細(xì)胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)的抑制率具有濃度依賴性和時(shí)間依賴性;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，高劑量DC9對(duì)HBV P基因的mRNA表達(dá)抑制作用與正常組相比，差異具有顯著性(P＜0.01)，并且抑制作用強(qiáng)于陽性藥3TC對(duì)照組。
　　結(jié)論:
　　1、通過對(duì)10種受試物的抗HBV活性篩選，發(fā)現(xiàn)1種受試物DC9有明顯體外抗HBV活性。
　　2、DC9具有明顯的抗HBV的作用，其作用不僅抑制HBV分泌