免疫調(diào)節(jié)分子TIM-4在肺癌和系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的作用研究.pdf

1、研究背景：
　　T細(xì)胞免疫球蛋白域與黏蛋白域(T-cell immunoglo bulindo main and mucindomain，TIM)家族是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的的一個(gè)基因家族，參與多種免疫免疫性疾病的發(fā)生與發(fā)展。人類(lèi)TIM家族包括三個(gè)成員，分別是TIM-1、TIM-3、TIM-4。TIM-4區(qū)別于TIM-1、TIM-3的關(guān)鍵點(diǎn)在于其選擇性表達(dá)于抗原提呈細(xì)胞表面，特別是活化的樹(shù)突狀細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞表面。近期文獻(xiàn)報(bào)道，TIM-4

2、可表達(dá)于DC來(lái)源的惡性腫瘤、惡性組織細(xì)胞肉瘤以及朗格漢斯細(xì)胞肉瘤，另有病例報(bào)告顯示咽旁脂肪肉瘤中也可檢測(cè)到TIM-4的表達(dá)。
　　肺癌是一種高發(fā)病率及高致死率的常見(jiàn)惡性腫瘤，2014年最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，肺癌已經(jīng)成為全球致死率最高的腫瘤，而其發(fā)病率也高居第二位。課題組前期研究表明，TIM-4在人非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，其在肺癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤分化程度顯著負(fù)相關(guān)，且與腫瘤病人存活時(shí)間密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，TI

3、M-4IgV域具有可與整合素結(jié)合的Arg-Gly-Asp(RGD)基序，提示TIM-4可能具備一定的黏附功能。另外，TIM-4胞內(nèi)段無(wú)酪氨酸活化基序，無(wú)法直接介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。那么，高表達(dá)的TIM-4在肺癌進(jìn)展中發(fā)揮怎樣的作用？其作用機(jī)制如何？本研究將利用細(xì)胞及動(dòng)物模型探索TIM-4在肺癌發(fā)生發(fā)展中的具體作用及相關(guān)效應(yīng)機(jī)制。
　　TIM-4是TIM-1的天然配體，TIM-4與TIM-1相互作用可為T(mén)細(xì)胞提供協(xié)同刺激信號(hào)，促進(jìn)T細(xì)胞活化

4、增殖，也有研究表明TIM-4對(duì)T細(xì)胞活化呈雙重調(diào)控效應(yīng)。TIM-4還可促進(jìn)Th0細(xì)胞向Th2方向分化，TIM-4的多態(tài)性可能影響其與Tim-1的結(jié)合，打破對(duì)Th1/Th2細(xì)胞平衡的調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致哮喘及過(guò)敏性鼻炎的發(fā)生。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TIM-4可負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞的活性，顯著減輕ConA誘導(dǎo)的免疫性肝炎。另外，TIM-4可特異性結(jié)合磷脂酰絲氨酸，通過(guò)其IgV域的FG-CC'環(huán)識(shí)別凋亡細(xì)胞表面暴露的磷脂酰絲氨酸介導(dǎo)巨噬細(xì)胞對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬

5、，而凋亡細(xì)胞的清除障礙與自身免疫性疾病的發(fā)生密切相關(guān)。TIM-4缺陷小鼠出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞過(guò)度活化，凋亡小體清除障礙，自身抗體產(chǎn)生等自身免疫病樣癥狀，TIM-4和乳脂球蛋白表皮生長(zhǎng)因子8((milk fat globule EGFfactorⅧ，MFG-E8)同時(shí)敲除可促進(jìn)自身免疫病的進(jìn)展。最近文獻(xiàn)報(bào)道，TIM-4對(duì)于小鼠類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病具有雙重性，并將TIM-4作為治療關(guān)節(jié)炎的候選靶點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Sy

6、stem icLupus Erythematosus，SLE)病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中TIM-4mRNA的表達(dá)水平顯著高于正常人，且SLE患者TIM-4表達(dá)水平與疾病活動(dòng)狀態(tài)相關(guān)。那么TIM-4在SLE這一典型自身免疫病中究竟扮演什么角色呢？本研究利用SLE動(dòng)物模型初步探討了TIM-4在SLE進(jìn)展中的作用。
　　研究目的：
　　闡明TIM-4在肺癌發(fā)生、進(jìn)展中的作用及相關(guān)機(jī)制，為肺癌預(yù)防、診斷和治療提供新的候選靶點(diǎn);初步探討T

7、IM-4在SLE進(jìn)展中的作用，為自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制研究提供新的思路。
　　方法：
　　1.免疫組織化學(xué)染色
　　利用免疫組化試劑盒，對(duì)多器官組織芯片或裸鼠瘤體組織石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，檢測(cè)包括食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、腎癌、肺癌在內(nèi)的多器官腫瘤及癌旁組織和裸鼠皮下移植瘤組織中TIM-4的表達(dá)情況。
　　2.RT-PCR
　　收集人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H35

8、8、H1975、SPCA1、95D以及人單核細(xì)胞系THP1，Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，分別擴(kuò)增TIM-4及actinmRNA。同法檢測(cè)A549細(xì)胞中整合素亞基αⅤ、β3mRNA的表達(dá)。
　　3.載體構(gòu)建
　　以pcDNA3.0為骨架載體，以pcDNA3.0-hTIM-4為模板，構(gòu)建攜帶HA標(biāo)簽的人TIM-4全基因表達(dá)載體pcDNA3.0-hTIM-4-HA，再以此全長(zhǎng)載體為模板，構(gòu)建IgV域RGD基

9、序突變?yōu)锳AA的hTIM-4突變載體pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA，以及PS結(jié)合位點(diǎn)第119、120、121、122位氨基酸全部突變?yōu)楸彼岬耐蛔冚d體pcDNA3.0-hTIM-4（119-122mutant）-HA，以PCR、雙酶切、測(cè)序鑒定載體。
　　4.CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　將pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA載體以脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞

10、增殖，讀取OD450nm/630nm，繪制生長(zhǎng)曲線;將人TIM-4三種小干擾RNA及對(duì)照分別轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，同上檢測(cè)細(xì)胞增殖、繪制生長(zhǎng)曲線;pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體分別轉(zhuǎn)入A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后5天，CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖。
　　5.細(xì)胞周期檢測(cè)
　　pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM

11、-4(RGD-AAA)-HA三種載體分別轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，48h后PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。同上轉(zhuǎn)染小干擾及對(duì)照后檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　6.凋亡檢測(cè)
　　pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(119-122mutant)-HA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，24h后更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基，進(jìn)行血清饑餓以誘導(dǎo)凋亡，48h后收集細(xì)胞進(jìn)行Annexin/PI雙標(biāo)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)

12、胞凋亡。
　　7.WesternBlot檢測(cè)增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、周期蛋白以及凋亡相關(guān)蛋白A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體，轉(zhuǎn)染48h后收蛋白，WesternBlot檢測(cè)PCNA、CyclinA、CyclinB1、CyclinD1的表達(dá)。A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0

13、-hTIM-4(119-122mutant)-HA，同上檢測(cè)Nur-77、PARP、Bcl2、Caspase-3、Caspase-9、Cytochromec的表達(dá)。
　　8.免疫共沉淀(Co-IP)
　　A549細(xì)胞種于6孔板中，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-hTIM-4-HA，48h后收蛋白，分別用HA和αⅤβ3的抗體沉淀蛋白，WesternBlot檢測(cè)HA和αⅤβ3，驗(yàn)證TIM-4和αⅤβ3可以相互結(jié)合。
　　9.EdU免

14、疫熒光檢測(cè)細(xì)胞增殖
　　A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種載體，轉(zhuǎn)染后第4天進(jìn)行EdU檢測(cè)，熒光顯微鏡下觀察。
　　10.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
　　4-6w雄性BALB/c裸鼠，分為三組，皮下注射A549細(xì)胞，10d左右成瘤，待瘤體直徑長(zhǎng)至5mm左右時(shí)開(kāi)始瘤內(nèi)注射pcDNA3.0、pcDNA3.0-hTIM-4-HA、pcDNA3.

15、0-hTIM-4(RGD-AAA)-HA三種質(zhì)粒DNA，每間隔兩天注射一次，每次注射前量取瘤體長(zhǎng)和寬，繪制生長(zhǎng)曲線。14d后處死小鼠，剝離瘤體并稱(chēng)量瘤重，拍攝瘤體照片，取少量腫瘤組織多聚甲醛固定，制作石蠟切片。
　　11.SLE模型鼠的建立
　　6-8wBALB/c雌性小鼠，腹腔注射pristane500μl，每月取血清測(cè)抗dsDNA抗體、ANA抗體，鑒定模型。
　　12.Tim-4干預(yù)性處理
　　小鼠腹腔注射p

16、ristine，1.5m后分為2組，分別尾靜脈注射lentivirusTim-4RNAi及Nc，同上每月檢測(cè)尿蛋白，取血清采用ELISA方法檢測(cè)抗dsDNA抗體、免疫熒光法檢測(cè)ANA抗體，pristane注射11月后處死小鼠，取血清，取腹腔巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)，分離脾細(xì)胞進(jìn)行流式檢測(cè)，腎臟和肺組織OCT包埋，進(jìn)行冰凍切片。
　　13.免疫熒光
　　稀釋尾靜脈血清，免疫熒光檢測(cè)ANA;腎臟冰凍切片直接免疫熒光法標(biāo)記IgG、C3抗體，檢

17、測(cè)腎臟免疫復(fù)合物沉積情況。
　　14.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MDSC、Treg
　　脾臟研磨制成單細(xì)胞懸液，標(biāo)記CD11b、Gr1檢測(cè)MDSC;標(biāo)記CD4、CD25、Foxp3檢測(cè)Treg。
　　15.HE染色
　　腎臟和肺冰凍切片進(jìn)行HE染色，檢測(cè)腎臟和肺部炎癥損傷情況。
　　結(jié)果：
　　1.TIM-4在多器官腫瘤組織芯片中的表達(dá)
　　多器官腫瘤組織芯片免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明TIM-4表達(dá)于多種腫瘤組織

18、，其中食管癌、胃癌、結(jié)腸癌、直腸癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌組織中TIM-4的表達(dá)明顯高于癌旁組織。
　　2.LPS及細(xì)胞因子對(duì)TIM-4在肺癌細(xì)胞中表達(dá)的影響
　　RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，多種肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、H1299、H358、H1975、SPCA1、95D中都可檢測(cè)到TIM-4mRNA的表達(dá)，但TIM-4表達(dá)水平較低;LPS、IL-6、TNF-α、TGF-β刺激可誘導(dǎo)TIM-4的表達(dá)。
　　3.TIM-4對(duì)肺癌

19、細(xì)胞的生長(zhǎng)及增殖的影響
　　人TIM-4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，利用CCK-8分別于不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，結(jié)果顯示TIM-4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度顯著高于空載體對(duì)照組，Westernblot結(jié)果顯示PCNA表達(dá)顯著上調(diào)，經(jīng)EdU染色，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示TIM-4過(guò)表達(dá)組細(xì)胞增殖顯著高于對(duì)照組。與此相對(duì)應(yīng)，干擾TIM-4后可顯著抑制A549細(xì)胞的生長(zhǎng)。
　　4.TIM-4對(duì)肺癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響
　　人TI

20、M-4真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48h收集細(xì)胞，PI染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染TIM-4后可明顯促進(jìn)A549細(xì)胞在S期累積，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白CyclinA、CyclinB1、CyclinD1的表達(dá);而轉(zhuǎn)染TIM-4siRNA后抑制A549細(xì)胞在S期積累。
　　5.TIM-4與αⅤβ3在A549細(xì)胞中的結(jié)合
　　RT-PCR結(jié)果顯示，A549細(xì)胞中可檢測(cè)到αⅤ、β3mRNA的表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA3-h

21、TIM-4-HA后分別以HA及αⅤβ3抗體進(jìn)行Co-IP，結(jié)果顯示外源性TIM-4可與αⅤβ3相互結(jié)合。
　　6.TIM-4RGD基序突變對(duì)A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及細(xì)胞周期進(jìn)展的影響分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA，CCK-8、細(xì)胞周期、WesternBlot、EdU免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，TIM-4促進(jìn)A549細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及促細(xì)胞周期進(jìn)展的作用消失。

22、>　　7.TIM-4對(duì)Nur77表達(dá)及肺癌細(xì)胞凋亡的影響
　　轉(zhuǎn)染TIM-4后，Annexin-Ⅴ/PI雙標(biāo)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示TIM-4過(guò)表達(dá)抑制A549細(xì)胞的凋亡，WesternBlot結(jié)果顯示TIM-4轉(zhuǎn)染組Nur77表達(dá)降低，Bcl2表達(dá)升高，而PARP以及Cytochromec降低。
　　8.TIM-4PS結(jié)合位點(diǎn)突變對(duì)A549細(xì)胞凋亡的影響
　　分別轉(zhuǎn)染pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4

23、-HA、pcDNA3-hTIM-4(119-122mutant)-HA，Annexin-Ⅴ/PI染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIM-4PS結(jié)合位點(diǎn)突變載體抑制A549細(xì)胞凋亡的作用降低。
　　9.TIM-4在體內(nèi)對(duì)肺癌生長(zhǎng)的影響
　　利用A549細(xì)胞接種于裸鼠進(jìn)行皮下成瘤，分別瘤內(nèi)注射pcDNA3、pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4(RGD-AAA)-HA質(zhì)粒DNA，通過(guò)測(cè)量腫瘤體積、

24、稱(chēng)瘤重，發(fā)現(xiàn)野生型TIM-4質(zhì)粒注射組腫瘤生長(zhǎng)速度明顯快于空載體對(duì)照組，而RGD基序突變質(zhì)粒注射組與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，pcDNA3-hTIM-4-HA、pcDNA3-hTIM-4（RGD-AAA）-HA質(zhì)粒DNA注射組腫瘤組織中可檢測(cè)到較高水平的TIM-4表達(dá)，野生型TIM-4注射組Ki67表達(dá)明顯強(qiáng)于對(duì)照組，而RGD突變組與對(duì)照組無(wú)明顯差異。
　　10.Pristane誘導(dǎo)SLE小鼠模型的建立

25、　　通過(guò)定期檢測(cè)ANA抗體、抗dsDNA抗體證實(shí)小鼠SLE模型成功建立。Pristane腹腔注射后4周，腹腔中細(xì)胞數(shù)量明顯增加，外周血ANA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有不同的核型，包括均質(zhì)型、核少點(diǎn)型、核膜型。
　　11.Tim-4慢病毒干擾對(duì)dsDNA、ANA、血清免疫復(fù)合物的影響
　　Tim-4慢病毒干擾組及對(duì)照組血清dsDNA、ANA無(wú)顯著差別，血清循環(huán)免疫復(fù)合物檢測(cè)結(jié)果也無(wú)明顯差別。
　　12.Tim-4干擾對(duì)腎臟IgG、C3免

26、疫復(fù)合物沉積的影響
　　腎臟免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，TIM-4慢病毒干擾組IgG、C3免疫復(fù)合物沉積明顯多于對(duì)照組。
　　13.Tim-4干擾對(duì)腎臟和肺損傷的影響
　　腎臟、肺組織HE染色顯示，Tim-4慢病毒干擾加重腎臟和肺部炎癥損傷。
　　14.Tim-4慢病毒干擾對(duì)腹腔巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)和脾臟MDSC、Treg的影響
　　Tim-4慢病毒干擾組及對(duì)照組腹腔灌沈液巨噬細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)差別，脾臟流式檢測(cè)MDSC、Tre

27、g無(wú)差別。
　　結(jié)論：
　　1.TIM-4可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、細(xì)胞周期進(jìn)展，抑制肺癌細(xì)胞的凋亡;
　　2.TIM-4通過(guò)其IgV域RGD基序與整合素αⅤβ3相互結(jié)合促進(jìn)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖;
　　3.TIM-4可能部分通過(guò)其PS結(jié)合位點(diǎn)抑制肺癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)肺癌進(jìn)展;
　　4.TIM-4干擾加重SLE模型鼠腎臟免疫復(fù)合物沉積以及腎臟和肺部炎癥損傷。
　　創(chuàng)新點(diǎn)及意義：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)新