Tim-3、Tim-4與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種典型的慢性自身免疫性疾病,在我國發(fā)病率高、預(yù)后差。SLE的發(fā)病機制十分復(fù)雜,其中凋亡細胞清除障礙是目前公認的重要發(fā)病機制之一。Tim(T cell immunoglobulin domain andmucin-domain-containing molecule)是2001年新發(fā)現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)分子家族,它們在調(diào)節(jié)過敏、哮喘、移植耐

2、受、自身免疫以及介導(dǎo)凋亡細胞清除中起重要作用。Tim分子具有獨特的結(jié)構(gòu),其胞IgV區(qū)含有磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)結(jié)合位點,人類Tim家族的三個成員Tim-1、Tim-3和Tim-4都能夠識別PS。文獻報道,Tim-1僅表達于Th2細胞,不表達于吞噬細胞。Tim-3主要達在Th1細胞上,負性調(diào)節(jié)Th1細胞的免疫反應(yīng)。近來發(fā)現(xiàn)Tim-3也表達在固有免疫細胞如巨噬細胞和樹突狀細胞,介導(dǎo)凋亡細胞的吞噬。Tim-

3、4選擇性表達于抗原提呈細胞,尤其高表達于巨噬細胞,能夠介導(dǎo)對凋亡細胞的攝取、吞噬和免疫耐受。已有研究表明,Tim-3分子的單個核苷酸多態(tài)性(SNP)易感于特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),SLE患者Tim-3 mRNA表達水平高于正常人,但無顯著性差異,而SLE病人中Tim-4的mRNA表達水平顯著增高,提示Tim-3和Tim-4分子可能通過影響凋亡細胞吞噬參與SLE的發(fā)生。本課題首次從凋亡細胞清除障礙入手探討T

4、im-3和Tim-4分子在SLE發(fā)生中的作用及Tim-4的單個核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)與SLE發(fā)生的相關(guān)性。
　　目的：
　　檢測Tim-3和Tim-4在SLE單個核細胞中的表達水平;分析其表達水平與疾病活動度的相關(guān)性以及Tim-4分子啟動子區(qū)域-1419(rs6874202)、-1609(rs62382402)位點SNP與SLE發(fā)生的相關(guān)性。
　　方法：

5、r>　　1.檢測Tim-3和Tim-4分子在單個核細胞中的表達
　　1.1流式細胞術(shù)檢測外周血CD14+細胞上Tim-3的表達
　　收集SLE患者和健康對照者的肝素抗凝血,破紅細胞,以熒光標(biāo)記的CD14、Tim-3抗體進行染色,流式細胞術(shù)檢測Tim-3在外周血CD14+單核細胞上的表達。
　　1.2實時定量PCR檢測外周血單個核細胞上Tim-4 mRNA的表達
　　收集SLE患者的肝素抗凝血,分離患者外周血單個核

6、細胞(peripheral bloodmononuclear cells,PBMC)。用Trizol法抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成為cDNA后,用subgreen熒光探針法以實時定量PCR檢測Tim-4 mRNA表達水平。
　　2.Annexin-V/PI雙染流式細胞術(shù)檢測外周血細胞凋亡
　　收集SLE患者和健康對照者的肝素抗凝血,破紅細胞后,加入2ml冰預(yù)冷的PBS,1000rpm離心5min,棄去上清,加入PBS進行細胞計數(shù),

7、取2X105個細胞,離心后棄掉PBS,加入500μl凋亡檢測用緩沖液,混勻后,避光加入FITC標(biāo)記的Annexin-V2μl及PI2μl混勻,室溫避光孵育10min,流式細胞儀檢測細胞凋亡的情況。
　　3.流式細胞術(shù)檢測Tim-3和Tim-4基因轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞對凋亡細胞的吞噬作用
　　構(gòu)建人Tim-4真核表達載體pcDNA3.0-hTim-4。小鼠胸腺細胞以10μmol/L地塞米松于無血清培養(yǎng)基孵育4h誘導(dǎo)胞凋亡,

8、并用Phrodo-SE進行標(biāo)記。利用脂質(zhì)體將pcDNA3.0-hTim-3和pcDNA3.0-hTim-4轉(zhuǎn)染HEK293T細胞,轉(zhuǎn)染24h后,與凋亡的胸腺細胞以1:10比例混合于37℃孵育90min,流式細胞術(shù)檢測胸腺細胞的凋亡率及HEK293T細胞轉(zhuǎn)染前后對凋亡細胞的吞噬情況。
　　4.PCR和測序分析Tim-4基因啟動子區(qū)域-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)兩位點基因多態(tài)性
　　收集1

9、79例SLE患者和168例健康對照者的肝素抗凝血,用血液基因組提取試劑盒抽取外周血DNA,用PCR擴增含有Tim-4基因-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點的600bp基因片段,然后將PCR產(chǎn)物送到公司純化并測序。測序結(jié)果經(jīng)Blast比對分析,確定-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點的基因型,計算基因型及等位基因頻率。
　　5.統(tǒng)計學(xué)分析
　　運用Gra

10、phPad Prism5軟件來對實驗數(shù)據(jù)進行了Mann-Whitney非參數(shù)U檢驗、one-way ANOVA分析和Spearman相關(guān)性分析。采用SPSSl3.0軟件包進行Hardy-weinberg平衡定律和卡方檢驗。認為P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.SLE患者外周血細胞凋亡水平顯著高于健康對照組,而且細胞凋亡率與補體3(C3)呈負相關(guān),與SLE疾病活動度(SLEDAI)呈正相關(guān)。
　　流式結(jié)果顯

11、示,SLE患者外周血Annexin-V/PI雙標(biāo)中Annexin-V+細胞的百分率即細胞凋亡水平(31.14%±11.3%)顯著高于健康對照組(17.57%±6.94%)(P＜0.0001)。經(jīng)Spearman相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血細胞凋亡水平與C3水平呈良好負相關(guān)(P:0.0171,r=-0.5692),與SLEDAI評分呈正相關(guān)(P=0.0408,r=0.3635),與dsDNA和C4沒有相關(guān)性。高水平的抗雙鏈DNA抗體(

12、anti-dsDNA)、低水平的C3、C4和疾病活動性相一致。
　　2.SLE患者外周血CD14+細胞上Tim-3的表達水平在疾病活動期(SLEDAI＞5)高于健康對照組,且與anti-dsDNA呈正相關(guān)。
　　流式結(jié)果顯示,處于活動期的SLE患者(SLEDAI＞5)CD14+細胞上Tim-3的表達水平(58.62%/±19.58%)顯著高于健康對照組(41.96%±21.97%)(P=0.0265)。但是在疾病非活動期CD

13、4+細胞上Tim-3的表達水平與健康對照組以及疾病活動期都沒有明顯差別。另外,SLE患者CD14+細胞上Tim-3的表達水平與anti-dsDNA成正相關(guān)(p=0.0471,r=0.4379),與C3、C4和SLEDAI評分沒有相關(guān)性。
　　3.SLE患者外周血細胞凋亡水平與CD14+細胞上Tim-3的表達水平呈正相關(guān)。
　　流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,SLE患者外周血細胞凋亡水平與CD14+細胞上Tim-3的表達水平呈良好正相

14、關(guān)(P=O.0338,r=0.3762)。
　　4.SLE患者外周血PBMC Tim-4 mRNA表達水平與臨床指標(biāo)無明顯的相關(guān)性。
　　SLE患者中外周血PBMC Tim-4 mRNA表達水平與凋亡水平、anti-dsDNA、C3、C4、SLEDAI評分并沒有相關(guān)性。
　　5.Tim-3和Tim-4促進HEK293T細胞對凋亡細胞的吞噬。
　　將pcDNA3.0-Tim-3和pcDNA3.0-Tim-4轉(zhuǎn)染HE

15、K293T細胞后并與凋亡的胸腺細胞共孵育,與轉(zhuǎn)染pcDNA3.0的HEK293T細胞的吞噬率(6.4%)相比,發(fā)現(xiàn)Tim-3和Tim-4能夠明顯促進HEK293T細胞對凋亡細胞的吞噬作用(Tim-3:15.8%;Tim-4:14.0%)。
　　6.Tim-4基因-1419(rs6874202)位點為GG基因型的SLE患者dsDNA水平和外周血細胞凋亡水平分別顯著高于GA/AA和GA基因型,而GG基因型的患者C3水平顯著低于AA基因

16、型。
　　測序結(jié)果顯示,SLE患者和健康對照組Tim-4-1419(rs6874202)和-1609(rs62382402)位點基因型分布和等位基因分布沒有差別。Tim-4-1419(rs6874202)位點GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA顯著高于GA及AA基因型的患者(P=-0.0335),而GG和GA基因型的SLE患者C3水平顯著低于AA基因型(p=0.0187),另外,發(fā)現(xiàn)AA和GG基因型的SLE患者細胞凋亡

17、水平顯著高于GA基因型的患者(p=0.0393)。
　　結(jié)論：
　　1.SLE患者細胞凋亡水平明顯高于對照組,CD14+細胞上Tim-3的表達水平在疾病活動期高于健康對照。
　　2.SLE患者外周血細胞凋亡水平與C3呈負相關(guān),與SLEDAI評分呈正相關(guān),患者CD14+細胞上Tim-3的表達水平與anti-dsDNA及細胞凋亡水平呈良好正相關(guān),提示Tim-3分子可能與SLE患者的凋亡細胞清除障礙有關(guān)。
　　3.中國

18、人群中存在Tim-4基因啟動子區(qū)-1419/-1609 G/A突變,且-1419位點GG基因型的SLE患者外周血anti-dsDNA和凋亡水平分別顯著高于GA/AA和GA基因型的患者,而GG基因型的患者C3水平顯著低于AA基因型,雖然未發(fā)現(xiàn)Tim-4基因啟動子區(qū)-1419/-1609位點SNP與SLE發(fā)生的相關(guān)性,但是-1419位點的GG基因型可能會影響SLE的病程進展和預(yù)后。
　　創(chuàng)新點及意義：
　　本研究首次發(fā)現(xiàn)SLE患