HBV轉錄后調節(jié)序列的功能研究及其在核酸疫苗中的應用.pdf

1、HBV轉錄后調節(jié)序列(HPRE)是乙肝病毒(HBV)基因組中在轉錄后水平調節(jié)HBV基因表達的調控序列，廣泛存在的細胞核因子即HPRE結合蛋白與該序列結合能促進mRNA向細胞核外轉移，從而促進病毒基因的復制和表達，同時，由某些細胞因子誘導產生的HPRE抑制性結合蛋白與該序列某些位置結合，抑制此環(huán)節(jié)，從而阻礙病毒基因的復制和表達。 豬囊蟲是豬帶絳蟲的幼蟲，在人體內寄生可引起囊蟲病。有關豬囊蟲病疫苗的研制有許多方法，包括蟲體來源的天然

2、抗原或重組抗原，蛋白亞單位疫苗，以及核酸疫苗。90年代發(fā)展起來的核酸疫苗具有能夠激發(fā)機體全面免疫發(fā)應、不散毒、便于儲存和運輸等優(yōu)點，具有潛在的應用價值，但其潛在的危險性也是關注的焦點。已有研究證明以豬囊蟲共同抗原基因制備的核酸疫苗具有良好的保護率。 本研究首先以熒光素酶(luciferase，LUC)基因為報告基因，將HBV轉錄后調節(jié)序列(HPRE)以及缺失不同功能區(qū)域的HPRE片段插入報告基因下游，構建以下真核表達質粒： pc

3、DNA3.0-luc、pcDNA3.0-luc-HPRE、 pcDNA3.0-luc-HPREβ<,1>β<,2>、pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,2>及pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,1>，轉染真核細胞，以重組人IFN-α作為誘導產生HPRE抑制性結合蛋白的刺激因子，在IFN-α作用前后，熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性的變化。發(fā)現缺失功能區(qū)域β<,2>后，IFN-α作用前后的熒光素酶活性變化不明顯，說明HPRE抑

4、制性結合蛋白主要與β<,2>發(fā)生作用。 在搞清楚HPRE抑制性結核蛋白結合區(qū)域后，將不含此區(qū)域的HPRE片段插入豬囊蟲核酸疫苗pPCV中，構建核酸疫苗pPCV-HP，免疫小鼠，測抗體滴度，并于兩周后用豬絳蟲卵攻擊，三個月后解剖觀察豬囊尾蚴數，結果顯示核酸疫苗pPCV-HP的抗體滴度高于核酸疫苗pPCV，其保護率也比核酸疫苗pPCV的保護率高8％。采集豬各組織和豬舍環(huán)境中的糞便及土壤樣品，提取各組織的總DNA和卡那抗性菌的質粒，P