胃食管反流病患者食管粘膜claudin4的表達(dá)變化及機(jī)制研究.pdf

1、胃食管反流病(Gastroesophagealrefluxdlisease,GERD)包括非糜爛性反流病(non-erosiveesophagealrefluxdisease，NERD)、反流性食管炎(refluxesophagitis，RE)和Barrett食管(BarrettEsophagus，BE)，是危害人們健康的常見疾病，嚴(yán)重者可發(fā)展成為食管腺癌。因GERD及其并發(fā)Barrett食管和食管腺癌的發(fā)病機(jī)制尚不明確，從一定程度上影

2、響了對它們的診斷和治療。 Claudin蛋白家族是近年來被發(fā)現(xiàn)的穿膜蛋白，是緊密連接最重要的組成部分，維持著緊密連接的特有的屏障功能和柵欄功能。在正常食管粘膜，claudin3和claudin4蛋白基本不表達(dá)；而在腸化的BE食管上皮細(xì)胞和食管腺癌組織中，二者表達(dá)明顯增高。NERD和RE是我國GERD最主要的2個(gè)亞型，然而迄今對claudin3、4在NERD和RE患者食管粘膜中的表達(dá)變化規(guī)律及其影響因素尚不清楚，在BE表達(dá)增高的信

3、號機(jī)制也未見報(bào)導(dǎo)。 為此，本課題重點(diǎn)進(jìn)行4方面的研究： 1.采用RT-PCR、westernblot和免疫組織化學(xué)等方法，分別對claudin3、4在正常食管、NERD、RE和BE粘膜上皮的表達(dá)情況進(jìn)行檢測，以此初步探討其在GERD臨床診斷和治療中的意義； 2.采用便攜式24hpH監(jiān)測儀及便攜式24h膽紅素監(jiān)測儀，對NERD和RE患者食管內(nèi)pH及膽紅素實(shí)行24h同步雙監(jiān)測，并用RT-PCR法檢測被測食管粘膜內(nèi)cl

4、audin4mRNA的表達(dá)變化，以此探討胃酸和膽汁酸反流與食管粘膜claudin4表達(dá)的聯(lián)系； 3.采用MTT法檢測胃酸、膽汁酸和TNF-α對小腸癌上皮細(xì)胞株活力的影響，以此選定合適的實(shí)驗(yàn)條件，再分別采用實(shí)時(shí)一PCR和激光共聚焦顯微鏡的方法，觀察胃酸、膽汁酸和TNF-α對小腸癌上皮細(xì)胞株claudin4mRNA和蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞內(nèi)分布的直接影響。 4.采用p38激酶特異性拮抗劑(SB203580)，通過阻斷p38激酶活

5、化前后，westernblot法檢測胃酸、膽汁酸誘導(dǎo)的claudin4蛋白表達(dá)的變化，以此研究p38激酶信號在胃酸和膽汁酸誘導(dǎo)的小腸上皮細(xì)胞claudin4表達(dá)變化中的作用。 主要結(jié)果如下： 1.對80例GERD患者食管粘膜進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)claudin3在正常食管，在NERD和RE的上皮，無論是mRNA，還是蛋白水平，不表達(dá)或微弱局灶表達(dá)；在腸化型BE上皮，claudin3明顯高表達(dá)。claudin4在正常食管上皮微弱或

6、不表達(dá)，而在NERD、RE和BE表達(dá)在mRNA和蛋白水平逐漸增強(qiáng)。免疫組化還發(fā)現(xiàn)claudin3、4的著色在NERD和RE粘膜上皮主要在細(xì)胞膜；對于BE，二者不僅胞膜，胞漿內(nèi)也出現(xiàn)陽性著色。 2.對其中的48例GERD患者進(jìn)行食管胃酸和膽紅素監(jiān)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NERD組以無反流為主，RE組以混合反流為主，二者構(gòu)成比相差顯著；NERD組和RE組在pH＜4總時(shí)間％、pH＜4臥位時(shí)間％、酸反流次數(shù)、DeMeester積分、abs＞0.14

7、臥位時(shí)間％和膽汁反流次數(shù)等6個(gè)參數(shù)上存在明顯差別(P＜0.05)；RE組食管粘膜claudin4mRNA的含量顯著高于NERD。單獨(dú)酸反流、單獨(dú)膽汁反流和混合反流組claudin4mRNA均顯著高于無反流組(P＜0.05)，單獨(dú)酸反流和單獨(dú)膽汁反流之間相差不顯著(P＞0.005)，混合反流組含量最高，顯著高于其他各組(P＜0.05)；GERD患者食管粘膜claudin4mRNA的含量與pH＜4臥位時(shí)間％、酸反流次數(shù)，DeMeester積

8、分，以及abs＞0.14臥位時(shí)間％和膽汁反流次數(shù)等5個(gè)參數(shù)明顯相關(guān)。 3.MTT法結(jié)果顯示pH選取的范圍在pH5.5～7.4，鵝脫氧膽酸(CDCA)50μM～200μM對小腸癌細(xì)胞株活力無明顯毒性，可以作為合適的研究條件。激光共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示CDCA或鹽酸隨著作用時(shí)間增加和濃度增大，claudin4mRNA和蛋白的表達(dá)逐步增加；在刺激因素下蛋白表達(dá)的增強(qiáng)在HIC細(xì)胞內(nèi)彌漫分布；在表達(dá)量和升高的速度上膽汁酸強(qiáng)于胃酸的作用；膽汁

9、酸在pH6.0的酸性培養(yǎng)基內(nèi)的作用更高于單獨(dú)膽汁酸的作用。TNF-α不同時(shí)間刺激后，claudin4mRNA和蛋白表達(dá)無顯著變化。 4.鹽酸、CDCA單獨(dú)或者混合刺激HIC細(xì)胞均可引起p38激酶活化，混合刺激活化p38激酶的程度明顯高于單獨(dú)刺激，同時(shí)伴有claudin4蛋白表達(dá)的增高，使用p38激酶信號途徑特異性拮抗劑SB203580，可以抑制p38激酶活化，同時(shí)可以抑制鹽酸或膽汁酸單獨(dú)刺激引起的claudin4表達(dá)的增高，也可

10、以部分抑制鹽酸和膽汁酸混合刺激引起的表達(dá)增高。 由上述結(jié)果得出以下結(jié)論： 1.提示claudin4表達(dá)的水平和粘膜病變程度密切相關(guān)，它表達(dá)增高有可能是食管粘膜上皮細(xì)胞緊密連接受損傷的標(biāo)志，易引起粘膜損害的進(jìn)一步加重；claudjn3是BE理想的診斷標(biāo)志物和治療的新靶點(diǎn)，claudin3作為BE食管標(biāo)志物的特異性要高于claudin4。 2.臥位酸、膽汁反流時(shí)間延長，反流的次數(shù)增多更易誘發(fā)RE，聯(lián)合反流的效果更加明

11、顯。膽汁酸可能和胃酸一樣，引起claudin4的高表達(dá)，因而也是獨(dú)立的食管粘膜損傷因子；胃酸、膽汁酸協(xié)同作用，更有致病性。臥位酸、膽汁反流時(shí)間和反流次數(shù)的增加是引起食管claudin4表達(dá)增高的重要因素。 3.膽汁酸或/和胃酸可能從基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平上直接影響barrett食管claudin4的表達(dá)，并具有時(shí)間和濃度效應(yīng)。膽汁酸的作用強(qiáng)于胃酸，混合反流效果更加明顯。盡管TNF-α未影響claudin4的表達(dá)，但它在barre