新型漏聲表面波生物傳感器的初步研制與應(yīng)用.pdf

1、目的：1.制備檢測和參比雙延遲線型漏聲表面波傳感器，采用相位、頻率及延遲時間等多種檢測方法，并比較各方法之間的優(yōu)缺點。 2.探索并優(yōu)化液相中Na+濃度、pH值等多種因素對漏聲表面波生物傳感器液相檢測系統(tǒng)的影響。 3.利用掃描隧道顯微鏡觀察傳感器裸金膜表面、探針固定、核酸雜交過程中生物分子與金顆粒之間的微觀變化。 4.通過實驗研究，初步構(gòu)建出新型漏聲表面波生物傳感器液相檢測系統(tǒng)。 方法：1.利用精細微加工方

2、法制備雙延遲線型漏聲表面波傳感器，并自行開發(fā)研制自激式振蕩電路，labview相位、頻率記錄分析軟件，將它們與網(wǎng)絡(luò)分析儀、頻譜分析儀及計算機聯(lián)用以構(gòu)建LSAW生物傳感器檢測系統(tǒng)。 2.分別以相位、頻率兩個指標檢測傳感器液相檢測反應(yīng)的一致性。 3.探索不同pH值和不同Na+離子濃度對傳感器的影響，探討雙通道傳感器受外界條件影響的一致性及最佳反應(yīng)條件的摸索。 4.用巰基末端修飾共價結(jié)合法將人乳頭瘤病毒的探針固定在漏聲

3、表面波生物傳感器的金膜表面，并觀察其與靶序列雜交的反應(yīng)，采用相位、頻率和延遲時間作為檢測方法，并比較不同方法的優(yōu)缺點。 5.在同一傳感器的金膜表面固定相同濃度的探針并與已知濃度的互補靶序列進行核酸雜交，實驗條件相同，傳感器再生使用10次。每次實驗結(jié)束后分別用piranha液、1MHCL和1MNaOH等溶液清洗傳感器反應(yīng)區(qū)域，探討漏聲表面波基因傳感器的再生性。 6.利用掃描隧道顯微鏡觀察探針固定時傳感器裸金表面、固定不同濃

4、度巰基化探針、單純加入靶序列以及巰基化探針和靶序列雜交后的金膜表面結(jié)構(gòu)的微觀變化。 結(jié)果：1.選擇Y方向切割36°旋轉(zhuǎn)、X方向傳播的LiTaO3晶體，正面拋光、背面打毛處理。在其上表面光刻兩個單相單向換能器(SinglePhaseUnidirectionalTransducer，SPUDT)，構(gòu)成低損耗延遲線型傳感器，傳感器結(jié)構(gòu)采用單基片雙路延遲線結(jié)構(gòu)。 2.自行研制的雙通道振蕩電路，在液相中起振非常容易，其相位/頻率穩(wěn)

5、定度達到實用要求，雙通道傳感器在氣相和液相中很穩(wěn)定，兩通道的一致性很好。 3.基頻是100MHz、金膜電極厚度在40nm的LSAW傳感器芯片最有利于核酸雜交檢測。 4.自行研發(fā)的labview相位、頻率記錄分析軟件具有自行設(shè)置各初始參數(shù)，實時記錄相位/頻率變化，具有自動繪制相位/頻率變化趨勢圖及分析結(jié)果等多項功能，采集、分析后的數(shù)據(jù)自動輸入到計算機。 5.雙通道LSAW傳感器相位檢測時，兩個通道變化量的相對差值比

6、較一致；對延遲時間測量時，結(jié)果也類似。 6.兩通道聲發(fā)出的表面波信號的相位差值隨溶液離子濃度、pH值的增大而發(fā)生明顯的變化。當pH7.6、Na+濃度0.2M時是傳感器進行核酸雜交的最佳反應(yīng)條件。 7.相位和頻率兩種檢測方法較好，尤其是鑒頻方法檢測雙通道LSAW傳感器的靈敏度約是壓電石英諧振式體波傳感器的20倍。 8.使用傳感器進行最后一次核酸雜交引起的相位變化值和平衡時間均與第一次相比，變異系數(shù)較小，說明LSAW

7、傳感器再生性較好。 9.掃描隧道顯微鏡下可以看到裸金膜表面金原子排列有序，而固定上1.0μM、2.0μM探針后，可見金膜表面探針分子在視野內(nèi)分布的密度逐步增加，間距縮小。金膜表面只覆蓋1.0μM靶序列時，金原子依然排列有序，但與裸金膜及固定探針時有所不同。固定1.0μM探針后與1.0μM靶序列雜交時，掃描圖像可見寡核酸分子密度更為密集，分子明顯延長，分布較為均勻。 結(jié)論：1.傳感器的檢測系統(tǒng)制備成雙延遲線型結(jié)構(gòu)，即在同一

8、塊LiTaO3晶體上同時鍍制檢測、參比兩路延遲線，其中參比延遲線是為了減低非特異性物質(zhì)的吸附。LiTaO3晶體為Y方向切割36°旋轉(zhuǎn)、X方向傳播LSAW。每個通道由一個漏聲表面波延遲線振蕩器構(gòu)成，叉指換能器的設(shè)計采用的是兩個單相單向換能器(SPUDT)結(jié)構(gòu)，收發(fā)叉指換能器之間是反應(yīng)區(qū)域。 2.高頻集成運算放大器通過延遲線型諧振器共同構(gòu)成正反饋回路，進而產(chǎn)生高頻振蕩信號，雙通道振蕩電路的設(shè)計和優(yōu)化使LSAW傳感器能夠在液相中更穩(wěn)定

9、地工作。 3.利用LabVIEW軟件進行人機界面和儀器控制及數(shù)據(jù)處理等后臺程序的編制，然后通過GPIB儀器控制卡向網(wǎng)絡(luò)分析儀傳送命令同時從儀器獲取測試數(shù)據(jù)并記錄在計算機上，同時以圖形曲線的方式顯示在顯示器上。 4.將上述組件組合在一起所構(gòu)建出雙通道LSAW傳感器液相檢測系統(tǒng)，為后續(xù)實驗搭建了堅實的技術(shù)平臺，相信也可以為臨床上病原微生物的檢測以及多種疾病的早期診斷提供一種與常規(guī)檢測方法完全不同的新方法。 5.最適合

10、用于雙通道LSAW基因傳感器的基頻是100MHz、金膜電極厚度為40nm。 6.成功設(shè)計出了雙通道LSAW傳感器，并證實兩個通道對外界反應(yīng)的一致性很好。 7.不同離子濃度、pH值溶液中傳感器換能器發(fā)出的電信號相位的變化也各不相同。將檢測通道變化的相位減去參比通道變化的相位，就是傳感器除去非特異性吸附后的相位值，即兩路延遲線換能器發(fā)出的電信號相位差值的變化隨離子濃度、pH值的升高而不斷變化。當pH7.6、Na+濃度0.2M

11、時是傳感器進行核酸雜交的最佳反應(yīng)條件。 8.在加入靶序列進行核酸雜交時，檢測通道和參比通道具有明顯不同的相位/頻率響應(yīng)，由于檢測通道反應(yīng)區(qū)域的表面固定了特異性的HPV探針，可與加入的靶序列特異性結(jié)合，發(fā)生核酸雜交反應(yīng)，相位發(fā)生明顯的變化；而參比通道加入的是非特異性的PBS緩沖液，與靶序列不可能發(fā)生特異性的堿基互補結(jié)合，所以相位沒有發(fā)生明顯的改變。因此，將兩通道的相位/頻率相減，即兩個通道之間的△p/△f才是真正反映因質(zhì)量的吸附而

12、引起的相位/頻率的改變，通過這種差值檢測技術(shù)可以有效的去除外界環(huán)境的干擾。 9.LSAW傳感器再生性較好，采用piranha液、1MHCL和1MNaOH等三種溶液連續(xù)洗脫，可以將傳感器反應(yīng)區(qū)域固定的所有物質(zhì)洗脫掉，包括探針、靶序列以及雜交后的寡核酸分子。由于LSAW傳感器的叉指換能器由硅橡膠密封，以保護叉指換能器電極，因此清洗的過程都不會對傳感器造成損傷。 10.掃描隧道顯微鏡可以形象直觀的對傳感器金膜表面、探針分子固定