神經(jīng)干細(xì)胞移植治療192-IgG-saporin AD模型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是老年人中最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床特點(diǎn)為隱襲起病，逐漸出現(xiàn)記憶力減退、認(rèn)知功能障礙、行為異常和社會(huì)障礙。由于該病病程長，致殘率高，又缺乏有效的治療方法，給家庭和社會(huì)帶來沉重的經(jīng)濟(jì)和精神負(fù)擔(dān)。因此，尋找有效的AD治療手段已成為迫切的課題。 AD的主要病理特征改變?yōu)槠べ|(zhì)、海馬等部位出現(xiàn)大量老年斑(senileplaques，SP)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibril

2、larytangles，NFT)，同時(shí)大量神經(jīng)元潰變壞死，其中以基底前腦膽堿能神經(jīng)元丟失最為嚴(yán)重，同時(shí)也伴有γ-氨基丁酸(GABA)能、去甲腎上腺素能和5-羥色胺能(5-HT)神經(jīng)元丟失。 AD研究進(jìn)展緩慢的一個(gè)重要原因是沒有一個(gè)理想的模型能夠再現(xiàn)該病的所有特征?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元退變是該病的顯著病理特征之一，對患者的行為認(rèn)知缺陷起非常重要的作用。為了探詢一種單純基底前腦膽堿能神經(jīng)元退變，分析這些神經(jīng)元的功能及尋找新的治療手段

3、，本課題采用選擇性免疫毒素192-IgG-saporin側(cè)腦室注射來建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型。目前AD的許多治療方法只能緩解AD患者的部分癥狀，有些藥物甚至?xí)a(chǎn)生嚴(yán)重的副作用。神經(jīng)干細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存在并體外培養(yǎng)成功，解決了腦細(xì)胞供體不足的難題，成為細(xì)胞移植的理想供體。神經(jīng)干細(xì)胞在體外自我復(fù)制，穩(wěn)定增殖；在體內(nèi)生長良好，具有多分化潛能，能遷移分化成不同的終末細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)研究內(nèi)容主要包括：1.側(cè)腦室注射建立免疫毒素192-IgG-sa

4、porin阿爾茨海默病動(dòng)物模型。2.神經(jīng)干細(xì)胞移植治療192-IgG-saporin阿爾茨海默病動(dòng)物模型的療效觀察。 實(shí)驗(yàn)部分： 1、材料和方法 1、新生SD大鼠的海馬，機(jī)械分離，加入胰蛋白酶和DNA酶消化分散，制成單細(xì)胞懸液，加入含2％B27、表皮生長因子(EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)(終濃度均為10ng/ml)的DMEM/F12無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，放置在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。將原

5、代培養(yǎng)約5-7天形成的細(xì)胞球離心，按上述條件半量換液，吹打成單細(xì)胞懸液；以后每5-7天傳代一次，方法同前。用免疫組織化學(xué)法，行Nestin染色，鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。 2、成年雄性SD鼠30只，體重210-250克，隨機(jī)分成3組，每組10只，分別為正常組、對照組、模型組和移植組。側(cè)腦室注射192-IgG-saporin5μl(2.5μg/5μl)，按坐標(biāo)：前囟后0.8mm、左側(cè)旁開1.5mm，進(jìn)針深5.5mm。21天后行Y

6、迷宮檢測，檢測結(jié)束后，將神經(jīng)干細(xì)胞球4μl(1×104個(gè)/μl)移植于同側(cè)基底前腦。坐標(biāo)：前囟前0.6mm、左側(cè)旁開0.6mm，進(jìn)針深5.5mm。分別在1、2、3、4周檢測神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的存活、遷移情況。各組動(dòng)物在干細(xì)胞移植后一個(gè)月行Y-迷宮空間學(xué)習(xí)、記憶能力的檢測。測試后動(dòng)物經(jīng)灌注、固定、取腦、蔗糖滲透，冰凍切片?；浊澳X切片行NGF-R免疫組化染色，對內(nèi)側(cè)隔核(MS)、斜角帶垂直支(VDB)的NGF-R陽性神經(jīng)元和進(jìn)行計(jì)數(shù)和形態(tài)學(xué)

7、參數(shù)的測定；海馬切片行膽堿能(AChE)纖維和突觸素(SYN)免疫組化染色，對海馬CA1區(qū)輻射層和齒狀回分子層AChE陽性纖維進(jìn)行計(jì)數(shù)，SYN進(jìn)行校正OD(光密度)測定。數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。 2、結(jié)果 1、海馬神經(jīng)干細(xì)胞能夠在EGF和bFGF的刺激下分裂增殖，一周左右形成由數(shù)十到數(shù)百個(gè)細(xì)胞組成的克隆細(xì)胞球。傳代后的神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的克隆細(xì)胞球，細(xì)胞形態(tài)不變。傳至第4代的克隆細(xì)胞球Nesti

8、n染色，結(jié)果呈陽性反應(yīng)。 2、1-4周神經(jīng)干細(xì)胞移植組鼠腦切片Nestin熒光染色顯示，體內(nèi)移植的神經(jīng)干細(xì)胞可以存活和遷移。 3、神經(jīng)干細(xì)胞移植對AD模型鼠基底前腦NGFR陽性神經(jīng)元的影響 建立192-IgG-saporin模型后4周后，模型組損傷側(cè)的MS和VDB的NGFR陽性神經(jīng)元大量減少，和正常組對應(yīng)側(cè)比較分別減少到18.40％和15.74％。 干細(xì)胞移植組損傷側(cè)的NGFR陽性神經(jīng)元得到補(bǔ)充和保護(hù)，移

9、植組損傷側(cè)的MS和VDB的NGFR陽性神經(jīng)元分別恢復(fù)到正常組的74.85％和71.66％，與模型組損傷側(cè)相比較均P＜0.01。 4、神經(jīng)干細(xì)胞移植對AD模型鼠海馬AChE陽性纖維的影響 模型組的CA1輻射層和齒狀回分子層AChE陽性纖維均大為減少，CA1輻射層和齒狀回分子層纖維密度分別減少到正常組的11.07％和12.96％，與正常組比較，均P＜0.01。移植組與損傷組比較，纖維有明顯增多，恢復(fù)到正常組的81.39％和7

10、5.30％。與損傷組比較均P＜0.01。 5、神經(jīng)干細(xì)胞移植對AD模型鼠海馬突觸素(SYN)的影響 模型組損傷側(cè)與正常組對應(yīng)側(cè)比較，CA1輻射層和齒狀回分子層突觸素顆粒，經(jīng)COD測定結(jié)果顯示分別減少到50.52％和57.03％，與正常組比較均P＜0.01。而移植組損傷側(cè)則分別恢復(fù)到正常組對應(yīng)側(cè)的68.66％和69.55％，與模型組比較均P＜0.05。。 6、神經(jīng)干細(xì)胞移植對AD模型鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的影響

11、 Y迷宮測試各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力，模型組學(xué)習(xí)、記憶能力明顯下降(107.38±9.34、3.75±0.71)，與正常組比較均有顯著差異(P＜0.01)；移植組(75.26±5.33、5.45±0.51)有所改善，與模型組比較均有差異(P＜0.05)。 7、線性相關(guān)分析 將神經(jīng)干細(xì)胞移植組的學(xué)習(xí)次數(shù)、記憶能力分別與NGFR陽性神經(jīng)元數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果呈顯著負(fù)相關(guān)和正相關(guān)關(guān)系，如MS：r1=-0.79，P＜0.01；r2

12、=0.76，P＜0.01;VDB：r1=-0.83，P＜0.01；r2=0.81，P＜0.01。 3、小結(jié) 1、新生SD鼠海馬提取的神經(jīng)干細(xì)胞，能夠利用無血清的培養(yǎng)基在EGF和bFGF刺激下傳代、增殖，且能在宿主體內(nèi)存活。 2、側(cè)腦室注射免疫毒素192-IgG-saporin，會(huì)導(dǎo)致基底前腦MS、VDB的NGFR陽性神經(jīng)元大量丟失；也導(dǎo)致海馬AChE陽性纖維、突觸素的減少和學(xué)習(xí)記憶能力的下降。表明免疫毒素192-