小麥矮腥黑穗菌常規(guī)PCR與實時熒光定量PCR檢驗檢疫技術(shù)研究.pdf

1、小麥矮腥黑穗病(Wheat dwarf bunt disease, DB)是麥類黑穗病中危害最大、極難防治的國內(nèi)外檢疫性病害之一,是由小麥矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa Kühn, TCK)引起的。主要分布在美洲、歐洲、北非和西亞,尤其是美國西北部7州。TCK與其近源種小麥網(wǎng)腥黑穗病菌(Tilletia caries(DC)Tul, TCT)在孢子形態(tài)、基因組水平上都具有很高的相似性,極難區(qū)分。國內(nèi)外學(xué)者曾經(jīng)利用

2、rDNA的轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列分析、隨機擴增的多態(tài)性DNA(Random amplified polymorphi c DNA,RAPD)、重復(fù)片段PCR(Repetitive-element PCR, rep-PCR)基因指紋分析等方法分析腥黑穗菌的種內(nèi)及種間差異,都沒有成功區(qū)分開TCK和TCT。TCK與TCT的孢子形態(tài)學(xué)上非常相似,極難分辨。因此能否精確鑒定這兩種腥黑穗病菌對于順利完成檢疫工作都是至關(guān)重要的。隨著輸華疫麥的大量流入,加之

3、幾種腥黑穗菌在形態(tài)上相互交叉,形態(tài)學(xué)檢驗工作量大,耗時費事,主觀性強,不能滿足進境原糧檢疫的快速通關(guān)以及進境后疫麥中病原菌消長動態(tài)與流向監(jiān)控的需求。因此建立TCK早期、快速、靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的分子檢測技術(shù)勢在必行。本研究以篩選到的1322bpTCK獨有差異基因設(shè)計TCK特異性引物對,建立TCK常規(guī)和定量熒光PCR技術(shù)體系,并研制出快速檢測試劑盒。其研究成果將有助于對種子、土壤、原糧加工副產(chǎn)品、飼料和廢棄物上病菌冬孢子流向和存活力進行動態(tài)

4、監(jiān)測,為制定科學(xué)的病害風(fēng)險管理策略和監(jiān)控方案提供技術(shù)支撐。論文主要研究結(jié)果如下:①優(yōu)化了堿裂解法破冬孢子外壁-CTAB破壞原生質(zhì)體,釋放核酸-微量DNA過濾柱去除色素、多酚等PCR抑制物質(zhì)的TCK/TCT冬孢子提取方法,排除了冬孢子細(xì)胞壁難破DNA難以提取,三甲胺、色素等PCR抑制物質(zhì)導(dǎo)致假陰性的難題,采用此方法提取的腥黑穗菌DNA完全適用于PCR擴增。對于TCK/TCT菌絲體DNA,采用了CTAB法和氯化芐法的大量提取。對于田間樣品,

5、FTA卡法制樣則實現(xiàn)了遠(yuǎn)程田間樣品的快速制備保存與安全寄送。②建立了常規(guī)PCR檢測體系。利用本實驗室前期篩選的TCK獨有的1322bp端粒差異片段,設(shè)計特異性引物對CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7,優(yōu)化了PCR反應(yīng)條件,建立了三套常規(guī)PCR檢測體系,其DNA擴增靶帶分別為747bp、200bp和644bp。選擇重組質(zhì)粒作為檢測中的陽性對照,健康小麥和健康黑麥基因組DNA作為陰

6、性對照。以腥黑穗菌屬通用引物對CQUTC6/CQUTC7為內(nèi)置對照,可以確定被檢樣品是否含PCR抑制物質(zhì)進而判斷檢測體系是否正確,同時有效地排除樣品檢測結(jié)果的假陽性和假陰性。利用設(shè)計的引物對CQUTCK2/CQUTCK3、CQUTCK4/CQUTCK5和CQUTCK6/CQUTCK7進行TCK PCR檢測,其特異性高,能擴增出美國全套小麥矮腥黑穗菌不同生理小種菌株的DNA片段,而對TCT的不同菌株和其他近源種DNA都不能擴增;PCR檢測

7、靈敏度可以達到0.1pg。采用建立的TCK PCR特異檢測技術(shù)體系,可以快速地鑒別小麥矮腥黑穗菌冬孢子和病菌純培養(yǎng)菌絲體。③首次建立了小麥矮腥黑穗菌的實時熒光定量PCR(Real time PCR, RTi-PCR)檢測體系。根據(jù)差端粒差異基因片段的堿基序列,運用引物設(shè)計軟件設(shè)計篩選出適用于SYBR Green I熒光染料和TaqMan雜交探針的定量PCR檢測的特異性引物對CQUTCK4/CQUTCK5及探針CQUP1,優(yōu)化RTi-PC

8、R反應(yīng)體系,成功地建立了兩種特異、準(zhǔn)確的小麥矮腥黑穗菌RTi-PCR檢測技術(shù)。檢測中用TCK的DNA重組質(zhì)粒梯度稀釋液建立了RTi-PCR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。兩種RTi-PCR檢測體系對DNA重組質(zhì)粒靶片段的檢測靈敏度可達1～2 fg,對TCK基因組DNA的檢測靈敏度可達5～10 fg,比常規(guī)PCR的靈敏度高出2～3個數(shù)量級?？梢钥焖勹b別小麥矮腥黑穗菌冬孢子和檢測罹病小麥植株體內(nèi)病菌的侵染菌絲體,實現(xiàn)了田間病害的早期診斷。④對來自田間或小麥加工

9、廠的帶菌樣品進行了雙盲檢測。運用常規(guī)PCR對人工摻加病菌冬孢子的小麥樣品進行了實際檢測,結(jié)果顯示能準(zhǔn)確擴增出健康小麥中每50克小麥攜帶的4000個TCK冬孢子。對混雜的小麥網(wǎng)腥黑穗菌DNA沒有擴增條帶;運用檢測體系分別對2006～2007年間采自國內(nèi)的196個黑穗菌菌癭或罹病小麥植株樣品進行實際檢測,結(jié)果顯示三套檢測體系的檢測結(jié)果是一致的,說明所建立的PCR檢測體系是穩(wěn)定可靠。分別采用兩種PCR對小麥不同生長期的發(fā)病情況進行了動態(tài)監(jiān)測,

10、常規(guī)PCR沒有靶帶產(chǎn)生,而實時熒光定量PCR的檢測最早可在三葉期或返青期早期檢出罹病小麥樣品的陽性信號。根據(jù)定量PCR監(jiān)測結(jié)果分析,罹病植株體內(nèi)病原菌的侵染菌絲體數(shù)量DNA含量極低,低于常規(guī)PCR的檢測下限約100x。說明熒光定量PCR檢測體系靈敏度高于常規(guī)PCR檢測體系,更適合于小麥系統(tǒng)侵染性病害的無癥樣品的早期監(jiān)測。⑤利用大分子穩(wěn)定化技術(shù)初步研制了固相化檢測試劑盒樣盒。采用核酸、酶的穩(wěn)定劑結(jié)合真空冷凍干燥技術(shù)成功制備出TCK的分子檢