實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在深部念珠菌感染早期診斷中的研究.pdf

1、近年來隨著廣譜抗生素、糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的廣泛應(yīng)用，深部真菌感染的發(fā)病率和死亡率也呈逐年遞增的趨勢(shì)。大量臨床資料和經(jīng)驗(yàn)表明，深部真菌感染的療效與轉(zhuǎn)歸，很大程度上取決于早期診斷和治療。目前研究顯示住院患者中60％的深部真菌感染是由白念珠菌引起，且其在人體中是致病狀態(tài)還是定植狀態(tài)，與它的繁殖數(shù)量有關(guān)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)非白念珠菌的檢出率已逐步增加，且耐藥性較高。因此，不僅要早期、快速診斷深部真菌病，還要在短時(shí)間內(nèi)盡快鑒別致病菌，以選擇敏感有效的藥

2、物進(jìn)行有效治療。 然而，臨床上深部真菌感染的診斷面臨著巨大的困難和挑戰(zhàn)，目前仍在沿用傳統(tǒng)方法，這些方法有耗時(shí)長(zhǎng)、易污染、難定量等缺點(diǎn)，很大程度上制約了早期診斷和治療，延誤了最佳治療時(shí)機(jī)。 鑒于目前存在的問題，本課題擬在其他研究基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)中的熒光嵌合法為基本原理，設(shè)計(jì)白念珠菌特異性引物，利用白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株構(gòu)建重組質(zhì)粒建立標(biāo)準(zhǔn)品，不斷優(yōu)化熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件，繪制成白念珠菌的循環(huán)閾值(Ct)與

3、拷貝數(shù)log(Copy number)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，其他待測(cè)樣品則根據(jù)其作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢測(cè)定量，從而得以快速檢測(cè)并明確診斷。 同時(shí)，為了進(jìn)一步快速鑒別五種常見念珠菌以選擇敏感有效的藥物進(jìn)行治療。我們嘗試?yán)谜婢ㄓ靡?，?gòu)建五種不同念珠菌的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，對(duì)其進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)并分別得到五種念珠菌特異性的融解溫度。融解溫度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列有關(guān)，對(duì)于某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。根據(jù)不同的融解溫度，使我們可

4、快速鑒別不同的致病菌種。 第一部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白念珠菌方法的研究 目的：探索利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白念珠菌的快速、可靠的新方法。 方法：在NCBI的Genbank中查找不同菌種的18SrRNA、5.8SrRNA、28SrRNA以及ITSⅠ、ITSⅡ基因序列，通過BLAST比對(duì)找出白念珠菌特異的基因序列，并保證此段高度保守。根據(jù)引物設(shè)計(jì)的原則，利用Primer5.0設(shè)計(jì)白念珠菌特異性引物，擴(kuò)增

5、目的基因片段大約為270bp。應(yīng)用特異性引物對(duì)白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行常規(guī)PCR，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，大約為270bp，紫光燈下切膠，試劑盒膠回收。將回收的片段與載體pMD18-T vector連接，構(gòu)建白念珠菌重組質(zhì)粒；將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5感受態(tài)細(xì)胞，在含氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上過夜篩選單克隆，提取重組克隆質(zhì)粒，10μl白念珠菌重組質(zhì)粒送至上海美孚公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，其余白念珠菌重組質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆脼闊晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)品。將鑒定好

6、的白念珠菌重組質(zhì)粒純化后，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行定量，根據(jù)重組質(zhì)粒的堿基長(zhǎng)度計(jì)算其分子質(zhì)量，根據(jù)分子質(zhì)量計(jì)算濃度，進(jìn)而計(jì)算每微升所含的拷貝數(shù)，10倍稀釋成5×107-5×103濃度梯度。在最佳反應(yīng)條件下，每個(gè)濃度平行加入3個(gè)反應(yīng)管同時(shí)進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 結(jié)果：白念珠菌重組質(zhì)粒測(cè)定稀釋后，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行定量擴(kuò)增，得出了一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及擴(kuò)增曲線圖。從而可以得出循環(huán)閾值(Ct)與拷貝數(shù)log(Copynu

7、mber)之間的線性關(guān)系表達(dá)式：y=-3.385x+42.80。熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白念珠菌最低能檢測(cè)到10個(gè)拷貝的基因，即相當(dāng)于(1-5)CFU/ml，同時(shí)與其他真菌、細(xì)菌及病毒等無交叉陽性反應(yīng)。 結(jié)論：實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)白念珠菌不僅具有較高的敏感性和特異性，而且可以對(duì)白念珠菌進(jìn)行定量。 第二部分實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速鑒別五種念珠菌方法的研究 目的：探索利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)快速鑒別五種常見念

8、珠菌的方法。 方法：應(yīng)用真菌通用引物ITS4和ITS86分別與白念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、熱帶念珠菌進(jìn)行常規(guī)PCR，產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增目的基因片段分別約為300bp、360bp、260bp、248bp、214bp。紫光燈下切膠，試劑盒膠回收。分別將膠回收的片段與載體pMD18-T vector連接，構(gòu)建五種不同念珠菌重組質(zhì)粒；分別將五種不同念珠菌的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5感受態(tài)細(xì)胞，含氨芐抗性的LB固體培

9、養(yǎng)基上過夜篩選單克隆，提取重組克隆質(zhì)粒，分別將10μl五種不同念珠菌重組質(zhì)粒送至上海美孚公司進(jìn)行測(cè)序鑒定，其余五種念珠菌重組質(zhì)粒-20℃保存?zhèn)溆脼闊晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)品。 將鑒定測(cè)序的五種念珠菌重組質(zhì)粒純化后，于紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行定量，根據(jù)重組質(zhì)粒的堿基長(zhǎng)度計(jì)算其分子質(zhì)量，根據(jù)分子質(zhì)量計(jì)算濃度，進(jìn)而計(jì)算每微升所含的拷貝數(shù)，分別10倍稀釋成1010-104濃度梯度。在最佳反應(yīng)條件下，五種不同念珠菌按1010-104濃度梯度同時(shí)進(jìn)行

10、擴(kuò)增，連續(xù)進(jìn)行8組相同反應(yīng)，結(jié)束后計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成特異性的融解溫度和繪制融解曲線圖。 結(jié)果：五種不同的念珠菌重組質(zhì)粒測(cè)定稀釋后，在最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，自動(dòng)生成融解溫度和融解曲線圖。該反應(yīng)生成的融解溫度與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列有關(guān)，對(duì)于某一PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其值是固定的。通過分析融解溫度和融解曲線，可以確定PCR反應(yīng)的特異性。五種不同的念珠菌有各自固定的融解溫度，根據(jù)該融解溫度的不同，可快速鑒別五種不同的念珠菌。 結(jié)