轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β不敏感的樹突狀細(xì)胞疫苗對(duì)小鼠肺轉(zhuǎn)移腎癌的免疫治療作用研究.pdf

1、目的：樹突狀細(xì)胞（DC）是一種最強(qiáng)的抗原遞呈細(xì)胞，目前在腫瘤疫苗中已被廣泛應(yīng)用。但是它們抑制腫瘤的能力經(jīng)常被腫瘤分泌的免疫抑制因子所抑制，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)。在本研究中，我們應(yīng)用TGF-β不敏感的DC疫苗免疫荷瘤小鼠來評(píng)論其對(duì)肺轉(zhuǎn)移腎癌的治療效果。我們應(yīng)用包含顯性負(fù)相II型TGF-β受體（TβRIIDN）基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒來感染腫瘤裂解物沖擊過的DC細(xì)胞。TβRIIDN能夠阻斷TGF-β向Smad-2的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致核內(nèi)下游基

2、因的轉(zhuǎn)錄被切斷。應(yīng)用TβRIIDNDC免疫Renca肺轉(zhuǎn)移癌的小鼠可以誘導(dǎo)強(qiáng)大的針對(duì)Renca的腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）反應(yīng)，抑制肺轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)小鼠生存期。這些結(jié)果顯示阻斷DC的TGF-β信號(hào)通路可以增強(qiáng)DC疫苗抗腫瘤的效率。
　　方法：1）構(gòu)建含有顯性負(fù)相TGF-βII型受體（TβRIIDN）質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒：含有TβRIIDN質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染293包裝細(xì)胞，32℃下共轉(zhuǎn)染12小時(shí)，10％DMEM培養(yǎng)基37℃下孵

3、化過夜，PBS漂洗后同樣條件再次轉(zhuǎn)染293細(xì)胞24小時(shí)，收集上清，獲得含有TβRIIDN重組逆轉(zhuǎn)錄病毒。2）負(fù)載小鼠腎癌Renca抗原的DC細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定：將Balb/c小鼠新鮮骨髓用紅細(xì)胞去除法獲取DC細(xì)胞，加入含rhIL-4（1000U/ml）、GM-CSF（1000U/ml）的完全培養(yǎng)基，隔日半量換液，在第6d梯度離心收獲非粘附細(xì)胞為非成熟的DC細(xì)胞。反復(fù)凍融獲得Renca細(xì)胞裂解物，裂解物反復(fù)刺激沖擊非成熟的DC細(xì)胞獲得負(fù)

4、載腎癌抗原的成熟DC細(xì)胞（TP-DC）。于光鏡下形態(tài)學(xué)鑒定，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型MHCclassII，CD40，CD11c，CD80和CD86。
　　3）DC細(xì)胞轉(zhuǎn)染，獲取TGF-β不敏感TP-DC細(xì)胞（TGF-βinsensitiveTP-DC）：含有TβRIIDN及GFP基因及單純GFP基因重組逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染負(fù)載Renca抗原的TP-DC細(xì)胞5％CO2、37℃下孵化48小時(shí)，獲得表達(dá)TGF-βinsensitiveTP-D

5、C細(xì)胞，及GFPTP-DC細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC細(xì)胞表型變化。
　　4）TβRIIDN-DC細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)：不同的DC細(xì)胞與TGF-β共同培養(yǎng)，脫氧胸腺嘧啶苷核素?fù)饺敕ㄟM(jìn)行增殖抑制實(shí)驗(yàn)，Westernblot檢測(cè)Smad-2和磷酸化Smad-2的表達(dá)。
　　5）DC疫苗體內(nèi)抗腫瘤評(píng)價(jià)：建立腎癌Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠模型Balb/c小鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別尾靜脈注射Renca細(xì)胞5×105個(gè)。于注射后第7天分別

6、皮下注射TGF-βinsensitiveTP-DC細(xì)胞、GFPTP-DC細(xì)胞、TP-DC細(xì)胞和新分離培養(yǎng)成熟的DC（na?veDC）第10天重復(fù)注射一次，觀察至第60天各組荷瘤小鼠的生存情況和肺重量的改變。
　　6）體外CTL活性及細(xì)胞因子檢測(cè)：取另一組同法建立的免疫后小鼠模型，最后一次疫苗免疫后10d取其脾臟，分離活化T淋巴細(xì)胞，51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定腫瘤特異性殺傷T細(xì)胞(CTL)對(duì)Renca細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。小鼠乳腺癌EMT-6

7、作為對(duì)照靶細(xì)胞。取小鼠血清行酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測(cè)定細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2變化情況。
　　結(jié)果：
　　1）流式細(xì)胞儀分析：小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞純度為84.88％。對(duì)GFP熒光分析提示TβRIIDN和GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染效率分別為92.13％和91.95％。對(duì)標(biāo)志成熟的表明分子MHCclassII，CD40，CD80和CD86的分析提示3種TP-DC明顯高于na?veDC（p<0.05），但3種TP-DC之間并

8、無明顯差異（p>0.05）。
　　2）Smad2磷酸化的檢測(cè)：western-blot顯示Smad2在4組DC中均存在，但是當(dāng)應(yīng)用TGF-β孵育后，磷酸化的Smad2（P-Smad2）只在GFPTP-DC,TP-DC,和na?veDC中存在，在TGF-βinsensitiveTP-DC并沒有見到P-Smad2。說明TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)被TβRII顯性負(fù)相表達(dá)所阻斷。
　　3）與TGF-β共同培養(yǎng)24h后，TP-DC，GFPT

9、P-DC和TGF-βinsensitiveTP-DCT的脫氧胸腺嘧啶苷核素?cái)z入抑制率分別為61.7±4.2％,62.3±3.5％和14.3±1.4％，TGF-βinsensitiveTP-DC的脫氧胸腺嘧啶苷核素?cái)z入抑制率與其他各組比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　4）在成功構(gòu)建的Renca肺轉(zhuǎn)移的小鼠模型上分別接種4種DC疫苗，TP-DC組肺重量及生存期均較na?veDC組有明顯差異（p<0.001）。TGF-β

10、insensitiveTP-DC組較其他兩組TP-DC也有明顯差異（p<0.05）。這些結(jié)果說明TGF-β不敏感的DC細(xì)胞能有效提高Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠的生存率降低肺轉(zhuǎn)移率。
　　5）51Cr釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)定顯示3組TP-DC組CTL殺傷活性均較na?veDC組強(qiáng)。但是最強(qiáng)的殺傷活性出現(xiàn)在TGF-βinsensitiveTP-DC組，在E:T為100：1時(shí)，殺傷活性為76.4％。所有DC組CTL對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞EMT-6無明顯殺傷作用

11、。結(jié)果表明阻斷的TGF-β信號(hào)通路能增加腫瘤特異性殺傷活性，提高DC疫苗的效能。
　　6）接種na?veDC的荷瘤小鼠體內(nèi)測(cè)出IFN-γ和IL-2基礎(chǔ)水平，接種各種TP-DC的荷瘤小鼠體內(nèi)IFN-γ和IL-2水平明顯升高，接種TGF-βinsensitiveTP-DC的荷瘤小鼠體內(nèi)該兩種細(xì)胞因子水平升高更明顯。
　　結(jié)論：
　　1）成功構(gòu)建了含有TβRIIDN質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)錄病毒；
　　2）采用小鼠腎癌細(xì)胞系Renc

12、a細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為抗原加載Balb/c小鼠骨髓DC，誘導(dǎo)出了腎癌的DC；
　　3）使用修飾后TβRII基因轉(zhuǎn)染腎癌特異性的DC，使TβRII顯性負(fù)相表達(dá)，阻斷TGF-β信號(hào)通路；
　　4）TβRIIDN并不影響轉(zhuǎn)染DC細(xì)胞的表型；
　　5）TGF-β不敏感的DC細(xì)胞能明顯提高Renca肺轉(zhuǎn)移小鼠的生存率，明顯抑制腫瘤生長(zhǎng)。
　　6）TGF-β不敏感的DC細(xì)胞誘導(dǎo)出最強(qiáng)的CTL殺傷活性，E/T比率為100:1時(shí)殺傷