平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)靶向微泡特異粘附效能的研究.pdf

1、目的：
　　 超聲分子影像技術(shù)是對(duì)粘附在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的特異分子進(jìn)行靶向性超聲對(duì)比成像。該技術(shù)應(yīng)用靶向性超聲微泡作為示蹤劑，這種靶向性超聲微泡既具有與紅細(xì)胞相似的流變學(xué)特征，可順利的通過組織微循環(huán)，又可與特異性靶向分子有效的結(jié)合，從而達(dá)到特異性地評(píng)價(jià)血循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞上分子學(xué)變化或?qū)崿F(xiàn)檢測血循環(huán)內(nèi)固定的靶分子的目的。臨床上有望用于評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮炎癥、檢測血栓形成或早期發(fā)現(xiàn)腫瘤等領(lǐng)域。實(shí)現(xiàn)該技術(shù)的核心就是構(gòu)建有效、特異的靶向超聲微泡。<

2、br>　　 通過生物素-親和素橋接法構(gòu)建靶向超聲微泡是目前國外研究較多的方法，但國內(nèi)無相關(guān)研究。此外，靶向超聲微泡構(gòu)建完成后其靶向粘附效能及其特異性的檢測是評(píng)價(jià)靶向微泡構(gòu)建成功與否的重要步驟。在體實(shí)驗(yàn)因體內(nèi)參與靶向微泡粘附的因素較多，難以準(zhǔn)確評(píng)價(jià)靶向微泡與靶目標(biāo)的粘附效能及其特異性。平行板流動(dòng)腔技術(shù)是體外研究細(xì)胞力學(xué)行為的主要手段之一，用其進(jìn)行白細(xì)胞對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞粘附的研究幾乎可以代替體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，提示平行板流動(dòng)腔法有望用于體外評(píng)價(jià)靶向微泡構(gòu)

3、建效果。
　　 本研究目的在于：1、探討“生物素化脂質(zhì)超聲微泡”的制備方法，同步探討平行板流動(dòng)腔法檢測MBb制備效果的可行性；2、探討應(yīng)用生物素-親和素橋接法制備“攜羊抗小鼠IgG單抗超聲微泡”，并應(yīng)用平行板流動(dòng)腔法體外評(píng)價(jià)自制MB-IgG特異靶向粘附小鼠IgG的能力；3、應(yīng)用生物素-親和素橋接法制備出“靶向小鼠P-選擇素超聲微泡”，利用平行板流動(dòng)腔模擬生理血流條件以評(píng)價(jià)其靶向粘附效能，為下一步在體評(píng)價(jià)血管內(nèi)皮炎癥及指導(dǎo)在體應(yīng)用

4、的環(huán)境范圍奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、MBb的制備及應(yīng)用平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)MBb的制備效果
　　 1、MBb的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　 通過聲振法制備出“普通脂質(zhì)微泡”和“表面載有生物素脂質(zhì)的超聲微泡”。庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測微泡的粒徑分布及濃度，普通光學(xué)顯微鏡下動(dòng)態(tài)觀察微泡的穩(wěn)定性；以大鼠腎臟模型評(píng)價(jià)MBb及MB的對(duì)比超聲顯影效果；并用生物素-親和素橋接法在其表面連接上FITC標(biāo)記的鏈親和素，熒光顯微

5、鏡鏡下觀察微泡的熒光情況以確定微泡表面是否帶有生物素化脂質(zhì)。
　　 2、平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)MBb的制備效果
　　 應(yīng)用包被不同濃度鏈親和素的聚苯乙烯培養(yǎng)皿作為平行板流動(dòng)腔體外檢測微泡粘附穩(wěn)定性的平臺(tái)。以包被高濃度鏈親和素的培養(yǎng)皿觀察普通脂質(zhì)微泡非特異性粘附效果為對(duì)照，分別采用鏈親和素高濃度包被、低濃度包被及空白培養(yǎng)皿檢測MBb粘附穩(wěn)定性，所有分組均按平行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)說明書要求檢測3個(gè)樣本；采用解離實(shí)驗(yàn)，每30s倍增剪切應(yīng)

6、力，分別檢測各組微泡達(dá)半數(shù)解離時(shí)的剪切應(yīng)力。
　　 二、平行板流動(dòng)腔體外評(píng)價(jià)MB-IgG的特異靶向粘附性能
　　 1、制備表面載有生物素化脂質(zhì)的超聲微泡后，采用生物素-親和素橋接方法構(gòu)建MB-IgG，庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測及顯微鏡下觀察微泡的粒徑分布和濃度。
　　 2、CEU評(píng)價(jià)MB-IgG顯影效果：SD大鼠2只，進(jìn)行下肢CEU，觀察下肢血管成像及肌肉灌注情況。
　　 3、用平行板流動(dòng)腔評(píng)價(jià)MB-IgG特異靶向

7、粘附性能
　　 在以不同濃度小鼠IgG包被培養(yǎng)皿的平行板流動(dòng)腔中，MB-IgG經(jīng)微量注射泵以固定剪切應(yīng)力通過，顯微鏡下觀察有微泡出現(xiàn)后開始錄像，分別檢測靶向微泡在不同時(shí)間點(diǎn)結(jié)合于平行板流動(dòng)腔中的數(shù)量，并以“1000ng/ml包被+大量羊抗小鼠IgG封閉”和“0ng/ml小鼠IgG包被”，評(píng)價(jià)平行板流動(dòng)腔法檢測MB-IgG的靶向粘附能力。各組樣本數(shù)均為3。
　　 三、模擬生理血流條件下靶向P-選擇素微泡對(duì)P-選擇素的特異粘

8、附效能
　　 1、利用生物素-親和素橋接法構(gòu)建靶向小鼠P-選擇素超聲微泡，庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測和顯微鏡下觀察微泡的粒徑分布及濃度。
　　 2、平行板流動(dòng)腔體外評(píng)價(jià)MBp靶向粘附效能
　　 2.1、結(jié)合實(shí)驗(yàn)：MBp經(jīng)微量注射泵以0.3dyn/cm2剪切應(yīng)力分別通過以不同濃度“小鼠P-選擇素Fc段”包被的平行板流動(dòng)腔；自顯微鏡下觀察到有微泡出現(xiàn)后開始連續(xù)錄像6min，觀察每分鐘微泡的靶向結(jié)合情況；以“1000ng/mlP

9、SFc包被+大量抗小鼠P-選擇素單抗封閉”和“0ng/ml PSFc包被”為對(duì)照；
　　 2.2、解離實(shí)驗(yàn)：平行板流動(dòng)腔以PSFc包被，流動(dòng)腔內(nèi)注入5×106/ml MBp約0.2ml后靜置5分鐘，先以0.9％生理鹽水沖洗掉靜止但未結(jié)合的微泡，待鏡下無游離的微泡后，每30s逐漸增加剪切應(yīng)力，直至微泡完全解離。20倍物鏡在固定的視野下全程錄像、拍照。
　　 結(jié)果：
　　 一、MBb的制備及應(yīng)用平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)MB

10、b的制備效果
　　 1、MBb的制備及理化性質(zhì)鑒定
　　 1.1、采用聲振法制備的MB及MBb在顯微鏡下觀察均為透亮微氣泡，庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測MB平均直徑為2.8μm，濃度為1.5×109個(gè)/ml, MBb平均直徑為2.71μm，濃度為1.3×109個(gè)/ml。所有微泡靜置過夜后均明顯分層，保存30天后觀察微泡形態(tài)及濃度無明顯改變
　　 1.2、熒光顯微鏡檢查見生物素-親和素橋接法連接的FITC-鏈親和素?zé)晒庵|(zhì)超聲

11、微泡，大小均一、結(jié)構(gòu)完整并帶有均勻的綠色光環(huán)，證實(shí)微泡表面成功攜帶生物素脂質(zhì)。
　　 1.3、經(jīng)大鼠外周靜脈注射MBb及MB均能獲得滿意的大鼠腎臟超聲顯影。
　　 2、平行板流動(dòng)腔法評(píng)價(jià)MBb的制備效果
　　 2.1、MBb可穩(wěn)定結(jié)合于鏈親和素包被的培養(yǎng)皿上，且其結(jié)合穩(wěn)定性隨著鏈親和素包被濃度的提高而增加；對(duì)于高濃度鏈親和素包被組，使MBb半數(shù)解離剪切應(yīng)力為dyn/cm2，當(dāng)剪切應(yīng)力達(dá)51.2dyn/cm2時(shí)微泡

12、才完全解離；
　　 2.2、MBb在沒有包被鏈親和素的空白培養(yǎng)皿上，于低切應(yīng)力條件下即見明顯的微泡解離，提示MBb不能穩(wěn)定結(jié)合于空白培養(yǎng)皿上；
　　 2.3、MB在高濃度鏈親和素包被的培養(yǎng)皿上，于低切應(yīng)力條件下即見明顯的微泡解離，說明MB難以穩(wěn)定結(jié)合于高濃度鏈親和素包被的培養(yǎng)皿表面。
　　 二、平行板流動(dòng)腔體外評(píng)價(jià)MB-IgG的靶向粘附效能
　　 1、應(yīng)用生物素-親和素橋接法成功制備MB-IgG，制備出的

13、MB-IgG形狀、大小及濃度與MBb相似；
　　 2、經(jīng)大鼠外周靜脈注射MB-IgG能獲得滿意的大鼠下肢血流及肌肉灌注顯影效果。
　　 3、在0.3dyn/cm2剪切應(yīng)力的流體狀態(tài)下，MB-IgG可與小鼠IgG包被的平行板流動(dòng)腔靶向結(jié)合，而封閉組及空白組在各時(shí)間點(diǎn)上均未見明顯靶向超聲微泡結(jié)合，不同濃度實(shí)驗(yàn)組在各時(shí)間點(diǎn)上均可見不同程度的微泡結(jié)合，且包被濃度與觀察時(shí)間之間存在交互作用，經(jīng)重復(fù)測量方差分析后并畫圖顯示其結(jié)合率隨

14、著平行板流動(dòng)腔上小鼠IgG包被濃度的提高而增加。
　　 三、模擬生理血流條件下靶向P-選擇素微泡對(duì)P-選擇素的特異粘附效能
　　 1、庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測及顯微鏡下觀察
　　 顯微鏡下MBb為透亮微氣泡，庫爾特計(jì)數(shù)儀檢測顯示其平均直徑2.71μm，濃度為1.3×109個(gè)/ml。制備出的MBp形狀無明顯變化、平均直徑為2.7μm，濃度為7.1×108個(gè)/ml。
　　 2、靶向微泡的結(jié)合
　　 2.1、平

15、行板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)顯示MBp可與PSFc包被的平行板流動(dòng)腔靶向結(jié)合，在血流剪切應(yīng)力為0.3dyn/cm2，MBp經(jīng)過不同濃度PSFc包被的的平行板流動(dòng)腔，重復(fù)測量方差分析顯示不同包被濃度與觀察時(shí)間之間存在交互作用，MBp結(jié)合率隨著平行板流動(dòng)腔上PSFc包被濃度的提高而增加，MBp幾乎不能與空白培養(yǎng)皿結(jié)合，同樣，MBp也難以與被抗小鼠P-選擇素單克隆抗體封閉掉位點(diǎn)的PSFc結(jié)合。
　　 2.2、PSFc包被濃度為1000ng/ml，給

16、予6種剪切應(yīng)力處理，可見MBp的靶向結(jié)合率受剪切應(yīng)力影響，且不同剪切應(yīng)力與觀察時(shí)間之間存在交互作用，結(jié)合的微泡早期隨著剪切應(yīng)力增大而增加，至0.5dyn/cm2剪切應(yīng)力作用時(shí)達(dá)最大結(jié)合，但隨著剪切應(yīng)力繼續(xù)增加，微泡結(jié)合率下降，不同剪切應(yīng)力處理組微泡結(jié)合率之間比較有顯著差異。
　　 3、靶向微泡的解離
　　 每30s增加一次剪切應(yīng)力對(duì)微泡的沖刷以觀察鏡下仍結(jié)合的微泡，其中PSFc包被濃度與剪切應(yīng)力間存在交互作用，并可見MB

17、p在高濃度PSFc包被的平行板更能抵抗血流剪切應(yīng)力，在濃度為1000ng/ml PSFc包被的平行板流動(dòng)腔中，約9.6dyn/cm2的剪切應(yīng)力方能使結(jié)合的MBp半數(shù)解離。
　　 結(jié)論：
　　 一、應(yīng)用聲振法制備生物素化脂質(zhì)微泡成功，此種微泡可通過生物素-親和素橋作用制備出攜帶各種靶分子的靶向微泡，為靶向超聲分子成像打下基礎(chǔ)。
　　 二、成功建立應(yīng)用平行板流動(dòng)腔檢測生物素化脂質(zhì)微泡對(duì)鏈親和素的靶向粘附效果的方法學(xué)；

18、該方法的建立對(duì)于在體外特異性的檢測靶向超聲微泡對(duì)靶分子的粘附效能有重要意義。
　　 三、應(yīng)用生物素-親和素橋接法構(gòu)建攜羊抗小鼠IgG單抗靶向微泡，并用平行板流動(dòng)腔證實(shí)該微泡對(duì)小鼠IgG的特異靶向粘附作用，提示應(yīng)用該構(gòu)建方法可以在生物素化脂微泡表面添加抗體。
　　 四、應(yīng)用生物素-親和素橋接法構(gòu)建了靶向P-選擇素的超聲微泡成功，并用平行板流動(dòng)腔體外模擬生理血流條件評(píng)價(jià)攜抗小鼠P-選擇素靶向微泡對(duì)小鼠P-選擇素的靶向粘附效能